抗體介導的排斥反應與臨床

蔡俊超

【編者按:本文根據(jù)蔡俊超教授在2010年中華醫(yī)學會泌尿外科學分會腎移植全國高峰論壇暨全國移植免疫高級研討班上授課內(nèi)容整理?！?/p>

關于器官移植排斥反應目前主要有兩個理論，即細胞學理論和抗體理論。倫敦國王大學的Peter Gorer最早提出抗體是引起排斥反應的主要介質，而牛津大學的Peter Medawar最早提出T細胞是介導移植器官免疫排斥反應的主要介質，他也因在器官移植免疫耐受方面的成就獲得1960年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。從20世紀50年代到21世紀以前，大量的實驗和臨床研究的結果都支持細胞免疫介導了移植器官的排斥反應，而且臨床上我們應用的免疫抑制劑如他克莫司、環(huán)孢素等，在作用機制上也主要特異性針對T細胞。由于Peter Gorer的早逝，抗體在器官移植排斥反應中的作用并沒有引起廣泛關注。從20世紀80年代開始，特別是進入21世紀后，由于各種檢測技術的發(fā)展，大量關于抗體和移植物排斥反應相關研究問世，最近10年來，抗體介導的排斥反應(antibody mediated rejection，AMR)的理論越來越受到重視。

1 AMR組織學診斷

最經(jīng)典的、國際上廣泛采用的AMR病理學診斷標準是Banff標準。1991年在加拿大Banff召開了第1次關于器官移植特別是腎移植排斥反應病理學診斷標準的國際會議，討論了如何從病理學上診斷急性或慢性、抗體或細胞免疫引起的排斥反應。但是此次會議并沒有在診斷標準上形成廣泛共識。以后每兩年在Banff召開會議對制定的標準進行討論修繕，直到1997年，第4屆Banff會議制定的移植腎排斥反應診斷標準被大部分的病理實驗室采用。Banff 97標準將AMR分為超急性AMR和加速性急性AMR兩類。當時認為這兩種AMR都是偏向于較早期的排斥反應。接著，2001年的Banff會議提出了C4d理論。C4d是抗體激活補體后所產(chǎn)生的補體片段，會沉積在腎小管間質毛細血管內(nèi)皮細胞表面，可以用免疫熒光的方法檢測。C4d沉積是診斷體液性排斥反應的標志，這一診斷標準的納入為診斷AMR找到了病理學方面的客觀證據(jù)。Banff 05標準首次將抗體介導的慢性排斥反應列入其中，由此AMR重新分為急性和慢性活動性兩類，而且規(guī)定AMR的診斷除了需要C4d沉積證據(jù)外，還需檢測到供者特異性抗體(donor-specific antibody)。Banff 05標準同時提出根據(jù)染色后C4d的彌散范圍即局灶性或彌散性來判斷由抗體介導的急性或慢性排斥反應的程度。在發(fā)現(xiàn)C4d沉積和檢測到抗體的情況下，AMR患者在組織形態(tài)學上可以沒有變化。因此，在最新的Banff 07標準中，AMR診斷進一步細分，將只有這些危險因子存在而沒有發(fā)生病理形態(tài)學變化的情況作為一類早期排斥反應。細分AMR診斷標準的意義在于臨床醫(yī)生或臨床病理學界已經(jīng)認識到抗體引起的排斥反應的重要性。

2 AMR抗體檢測技術

最早應用于AMR檢測抗體是交叉配型方法，這種方法需要供者的細胞。供者的淋巴細胞表面有供者特異性抗原，然后與受者血清反應。受者血清當中可能存在抗供者的抗體，這些抗體與供者的淋巴細胞反應，特異性抗體結合到細胞表面，在補體存在的情況下，激活補體可將細胞溶解。因為它是在微小的板上進行的，這種方法又稱為微淋巴細胞毒試驗(micro-lymphocyte toxicity test)，從機制上稱為補體依賴細胞毒作用(complement dependent toxicity，CDC)。對接受尸體供腎受者而言，沒有供者的細胞，則采用群體反應性抗體(penel reactive antibody，PRA)檢測方法。《新英格蘭醫(yī)學雜志》曾報道，用交叉配型和PRA兩種方法檢測抗體均陽性的情況下，超急性排斥反應發(fā)生的概率為80%;在PRA陽性交叉配型陰性的情況下超急性排斥反應發(fā)生的概率是15%;兩者均陰性的情況下排斥反應發(fā)生的概率是2.4%［1］。這項研究結果發(fā)布以后，20世紀70年代初這兩種檢測方法便逐漸被器官移植界所采用，幾乎所有的患者都用PRA或交叉配型的方法來檢測抗體情況，以預測會不會發(fā)生排斥反應。這兩種方法在應用一段時間后，人們又發(fā)現(xiàn)另外一個問題，即有部分患者在PRA和交叉配型均陰性的情況下，隨訪一段時間后也發(fā)生了排斥反應，人們開始懷疑這兩種方法的敏感性。人的抗淋巴細胞抗體是人免疫球蛋白，在檢測過程當中加入抗人球蛋白抗體作為二抗，可起到相互聯(lián)結的作用，使更多的補體被激活，基于此，有人設計了另外的實驗方法，在原來的PRA方法基礎上加入二抗來提高檢測敏感度。到20世紀80年代，流式細胞分析方法被應用于交叉配型，稱為流式細胞交叉配型，即用受者血清與供者的細胞產(chǎn)生反應。反應后不是用淋巴細胞毒的方法來判斷結果，而是采用尾部帶有熒光標記的抗體作為檢測標志。如果有一抗存在，尾部有熒光標記的二抗也會結合上去，再用流式細胞法判斷體內(nèi)是否存在結合了抗體的供者細胞。

綜上所述，以細胞為基礎的檢測抗體的方法在有供者細胞的情況下用CDC交叉配型，在沒有供者細胞存在的情況下用人群的細胞行PRA檢測。

到20世紀90年代，隨著分子生物學和蛋白生物化學的研究進展，可以直接用純化抗原來檢測抗體，如ELISA、流式細胞分析、Luminex等方法。這些方法的試驗原理基本相同，關鍵還是需要純化的抗原。近2年來，Luminex方法逐步替代流式細胞分析，它的優(yōu)勢在于其內(nèi)部標記熒光微珠的數(shù)量可以達到100，也就是說它可以同時檢測出超過100個不同抗原特異性的抗體，檢測時間和費用都大大下降。

比較上述以細胞為基礎的和以抗原為基礎的兩類檢測方法，可以看出前者較后者敏感性弱，這是因為細胞表面特異性的抗原如HLA、主要組織相容復合物Ⅰ類鏈相關基因A(major histocompatibility complex classⅠ chain-related gene A，MICA)等的量要遠遠低于人為純化出來包被到微珠上的抗原量。在以細胞為基礎的各種檢測方法中，CDC方法的敏感度要低于流式細胞交叉配型，因為CDC是一個功能性的方法，它只檢測有細胞毒的抗體，而流式細胞法只檢測抗體是否結合，它既包括有細胞毒的抗體，也包括沒有細胞毒的抗體。以抗原為基礎的各種檢測方法中，單一抗原(即一個微珠表面包被一個抗原)的敏感度遠遠高于混合抗原(一個微珠表面包被混合抗原)。從靶抗原特異性而言，交叉配型以供者細胞為基礎，靶抗原特異性很強，其抗體直接針對供者特異性抗原。而PRA是針對整個人群，靶抗原特異性相對要弱。單一抗原包括了供者特異性抗原，其針對某一靶抗原特異性高，而混合抗原檢測出來的是混合抗體，無法具體識別是針對哪一特定靶抗原。對靶抗原以細胞為基礎的檢測方法較以抗原為基礎的檢測方法有優(yōu)勢，前者的靶抗原有可能包括了HLA和MICA，以及一些未知的目前還無法確定的抗原;而以抗原為基礎的檢測方法，靶抗原是人工純化的抗原，特異性更高。以細胞為基礎的檢測方法，可以是功能性的如CDC方法，也可以不是功能性的如流式細胞交叉配型;而以抗原為基礎的檢測方法主要是看抗原抗體結合能力。以細胞為基礎的檢測方法直接以細胞為原料，受到的干擾可能較少;而以抗原為基礎的檢測方法，受到的干擾可能較多，如部分抗原發(fā)生變性后導致交叉反應。

3 抗體與排斥反應關系的臨床證據(jù)

現(xiàn)有證據(jù)表明，抗移植物抗體可能引起移植物功能喪失。

交叉配型和PRA兩種方法檢測抗體都是陽性的受者，超急性排斥反應的概率明顯高于抗體陰性的受者［1］。PRA＜10%、10% ～80%、＞80%的受者發(fā)生超急性排斥反應的概率分別為6%、16%和30%，發(fā)生原發(fā)性移植物無功能的概率分別為16%、24%和41%，高PRA受者明顯高于低PRA受者。關于PRA引起的急性排斥反應，1987年有學者用流式細胞PRA檢測，PRA陽性受者1個月后有33%發(fā)生了排斥反應，明顯高于PRA陰性受者的8%［2］。另一位學者用同樣的方法檢測，結果 PRA陽性者急性排斥反應發(fā)生率是20%，而PRA陰性者為7%［3］。最后一個證據(jù)是關于抗體引起的慢性排斥反應。美國器官分配聯(lián)合網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示，1995—2000年尸體腎移植移植物存活率隨時間呈直線下降，10年移植物存活率腎、心臟和肝分別為42%、52%和53%，慢性排斥反應導致的移植物功能的喪失在過去40年以來并沒有很好改善，平均每年有5%受者逐步喪失移植物功能，也就是說，今年移植的所有受者在20年后幾乎都要重新移植或者會面臨死亡。

從2002年開始有一個關于抗體和排斥反應相關關系的國際合作課題招募了近2000例患者，這些患者的移植物在當時均“功能尚好”，或者肌酐水平在1.0 ～ 1.2 mg/dL(88.4 ～ 106.1 mol/L)以下。收集他們的血清做抗體篩選，其中80%的患者抗體陰性，20%抗體陽性。隨訪3年，觀察每年移植物功能情況，抗體陰性者中2.9%發(fā)生移植物功能喪失，而抗體陽性者的失功率為8.7%，兩者間差異有統(tǒng)計學意義［4］。2年后，抗體陰性者6.8%發(fā)生了排斥反應，抗體陽性者15.1%發(fā)生排斥反應，兩者間差異也有統(tǒng)計學意義［5］。3年后，抗體陰性者有8.1%發(fā)生了排斥反應，而抗體陽性者高達24.5%發(fā)生排斥反應，兩者也有顯著的差異［6］。

這些證據(jù)表明抗體陽性會使排斥反應發(fā)生概率增高。既然抗體會引起排斥反應，那抗體應該出現(xiàn)在發(fā)生排斥反應之前，也就是在移植物功能發(fā)生變化之前就應該能檢測到抗體。有學者曾報道其隨訪的1例受者移植后不同時間檢測抗體和血清肌酐水平結果:兩者在移植后早期均維持穩(wěn)定，而至60～70個月時抗體水平突然明顯上升，從這時開始供者特異性抗體從陰性轉變?yōu)殛栃裕◆跃S持在之前的正常水平，因此沒有采取相應的臨床措施，最后導致肌酐發(fā)生了不可逆轉的上升;另1例患者也有類似的情況。若把患者分為兩組，一組為發(fā)生排斥反應受者，另一組為未發(fā)生排斥反應受者，排斥反應組很多在移植后早期就出現(xiàn)了抗體，到最后發(fā)生了移植物失功。而無排斥反應組大多抗體陰性，部分為弱陽性，少數(shù)為強陽性［7］。為進一步證實結果，我們開展了另一項國際合作課題，研究對象包含了近2000例不同器官移植受者。結果與前類似，腎移植抗HLA抗體陽性者在跟蹤隨訪4年后，移植腎存活率顯著低于抗HLA抗體陰性者。心臟移植、肺移植受者也類似，而肝移植受者中這種差異卻不甚顯著，是否與肝作為免疫特惠器官有關?

4 AMR機制

抗體引起移植器官排斥反應首先需要抗原抗體結合，最早的結合部位是血管內(nèi)皮細胞?？乖贵w結合后有4個通路可以引起內(nèi)皮細胞損傷。前3條通路與補體相關。第2條通路中補體被激活后，發(fā)生C4d沉積，同時，補體激活之后產(chǎn)生的片段可以吸引很多炎癥細胞到組織器官，移植物的慢性排斥反應也屬于炎癥過程。帶有補體受體的細胞，主要是單核細胞和中性粒細胞，補體與這些細胞上的補體受體結合之后引起細胞的吞噬作用，也可能造成內(nèi)皮細胞的損傷。第4條通路與補體無關，我們稱之為抗體依賴的細胞毒作用(antibody-dependent cytotoxicity)，它不需要補體的參與，而是在抗體結合到內(nèi)皮細胞之后，由帶有能結合抗體的Fc受體的吞噬細胞或NK細胞、單核細胞或中性粒細胞與抗體結合，可能對靶細胞產(chǎn)生殺傷作用。所有這些通路，最終都會導致內(nèi)皮細胞的損傷，這些損傷稱為原發(fā)性損傷。在此基礎上，由內(nèi)皮細胞損傷所導致的進一步損傷稱為繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷包括:(1)內(nèi)皮細胞損傷后基底膜暴露，進一步激活血小板并導致微血栓形成，這一機制是超急性排斥反應和急性排斥反應發(fā)生的主要機制，最后會導致血管閉塞;(2)內(nèi)皮細胞損傷之后，血管平滑肌會暴露在抗體、其他細胞因子或其他細胞之下，平滑肌細胞受損之后會更新復制，這一過程也可能對血管造成影響;(3)原來的內(nèi)皮細胞在損傷之后產(chǎn)生新的內(nèi)皮細胞進行補充，但是在內(nèi)皮細胞復制修復過程不可控制地也可能會對組織器官造成損害;(4)內(nèi)皮細胞損傷之后，可能使體內(nèi)的一些體液因子或細胞因子直接進入細胞間質，對其他一些非血管組織如腎小球、腎小管產(chǎn)生直接影響。前3種機制導致血管病變、狹窄和堵塞以及組織缺血等可引起組織結構功能改變，最終喪失功能。

綜上所述，在抗體引起排斥反應過程中，首先要產(chǎn)生抗體，其次是在臨床檢測或病理檢測中發(fā)現(xiàn)C4d沉積，在此基礎上進一步組織損傷，最后導致移植器官功能性指標如血清肌酐等上升。因此臨床見到血清肌酐水平發(fā)生變化的時候，也就是移植腎發(fā)生功能損害的時候，已經(jīng)相對較晚了。

5 AMR的預防和治療

預防和治療體液性排斥反應，主要包括以下措施:(1)去除體內(nèi)的抗體;(2)抑制和(或)去除產(chǎn)生抗體的細胞，這是最根本的治療方法，也是最終解決問題的方法;(3)對癥治療，延遲抗體導致的組織器官原發(fā)性或繼發(fā)性損傷;(4)其他措施，包括抑制補體功能、抑制機體固有免疫功能或T細胞免疫功能等。

5.1 去除或抑制體內(nèi)的抗體

血漿置換是將患者血漿當中存在的抗體濾過后再回輸血漿，這一過程也可以將補體等成分一起去除。免疫吸附方法最早應用于ABO血型不匹配移植受者，但是目前尚無商品化的能在移植前特異性吸附HLA抗體的產(chǎn)品，而且因為技術原因以及吸附程度的不確定，這一方法在國際上并沒有廣泛應用，但這不失為一種值得考慮的方法。靜脈輸注免疫球蛋白包含了來源于成千上萬不同人的抗體成分，可能會特異性地阻斷抗移植物特異性抗體結合抗原的部位，也可能會阻斷移植物抗原上結合宿主抗體的部位。有研究認為靜脈輸注免疫球蛋白有抑制補體激活的功能，可能通過阻斷或下調(diào)Fc受體的功能來發(fā)揮作用，當然可能還有其他機制存在。

5.2 抑制或去除產(chǎn)生抗體的細胞

這類措施包括以下:(1)脾是B細胞產(chǎn)生的主要器官，脾切除后可以去除大量的B細胞，對受者接受移植物有很大的幫助。2000年初日本東京大學的研究者開始對ABO血型不匹配的移植受者實施脾切除術。因為日本的移植器官來源非常緊缺，即使親屬供者ABO血型不匹配也會實施移植手術，而ABO血型不匹配導致的排斥反應甚至超過HLA不匹配引起的排斥反應。(2)T細胞免疫抑制劑，包括環(huán)孢素、他克莫司、雷帕霉素等，因為B細胞產(chǎn)生抗體依賴于T細胞幫助，這些藥物也間接抑制了B細胞產(chǎn)生抗體。(3)輔助免疫抑制，主要指嗎替麥考酚酯，少數(shù)為硫唑嘌呤，其作用直接針對分裂細胞，對T細胞、B細胞都有抑制功能，相對環(huán)孢素、他克莫司、雷帕霉素等藥物而言，嗎替麥考酚酯、硫唑嘌呤對產(chǎn)生抗體的B細胞的作用更直接、更有效。(4)特異性針對淋巴細胞的單克隆抗體或多克隆抗體，較早期應用的如抗淋巴細胞球蛋白、抗CD3+T淋巴細胞單克隆抗體(basiliximab)，現(xiàn)在逐漸被抗胸腺細胞球蛋白、抗CD52單克隆抗體(alemtuzumab)所取代。近幾年來，抗CD20單克隆抗體(rituximab)的應用越來越多。CD20是B細胞表面的主要標志，抗CD20單克隆抗體對B細胞有殺傷或抑制作用。以上(2)～(4)點所提到的治療方法都是直接或間接作用于B細胞，從而控制體液免疫導致的排斥反應。(5)硼替佐米(bortezomib)是一種蛋白酶抑制劑，其作用機制是抑制蛋白酶，阻斷核因子-κB介導的信號傳導通路，誘導所有分裂細胞主要是漿細胞死亡。硼替佐米最早用于治療多發(fā)性骨髓瘤，基于多發(fā)性骨髓瘤主要是漿細胞來源的腫瘤，而抗體主要產(chǎn)生于漿細胞的認識，將硼替佐米應用于器官移植領域。我們中心組織的一項由30～40個中心參與的國際合作項目應用硼替佐米結合血漿置換治療體內(nèi)存在抗體的患者，在應用了幾個劑量之后，抗體水平回落到陰性或弱陽性。

5.3 對癥治療

(1)抗凝治療。在急性排斥反應期血栓形成是排斥反應發(fā)生的主要機制之一，抗凝治療在這個階段可以很快逆轉超急性排斥反應。(2)激素沖擊治療。盡管不斷有新的免疫抑制劑問世，但是糖皮質激素仍是一線免疫抑制劑，目前仍有90%以上患者在使用類固醇激素，它對B細胞也有直接的殺傷作用。(3)阻斷補體激活通路的抗C5單克隆抗體(eculizumab)，它通過阻斷C5的裂解，抑制由抗體引起的CDC，從而用于抗急性排斥反應。這一作用的結果是阻斷了補體的激活通路，但是抗體仍在體內(nèi)存在。有學者將eculizumab用于因災難性抗磷脂抗體綜合征而行腎移植的患者，患者移植前給1次高劑量(1200 mg)，移植后 1、6、9、14 d 分別給予低劑量(900 mg)，在21、35 d再給予高劑量，使其血藥濃度在體內(nèi)呈一個波動過程［8］。體外實驗也表明，開始時溶血指標較明顯，用eculizumab之后溶血指標幾乎為零，從而使溶血得到很好的控制。該例受者移植后肌酐水平穩(wěn)定在1.0 mg/dL(88.4 mol/L)左右。

前面所提到的一些治療措施，是針對臨床上發(fā)現(xiàn)這些患者已經(jīng)有排斥反應，功能已經(jīng)發(fā)生改變的情況下所采取的相應治療。而如果在移植后跟蹤觀察，在患者臨床功能指標沒有發(fā)生改變或沒有任何臨床癥狀的情況下，檢測抗體出現(xiàn)陽性的結果，說明這些患者的免疫功能沒有得到有效控制，提醒臨床醫(yī)生要很關注這部分患者，因為他們很可能在出現(xiàn)抗體一段時間(平均11個月)之后，有的在1個月之內(nèi)，有的會持續(xù)10多年以后發(fā)生排斥反應。機體內(nèi)抗體水平因免疫抑制劑使用情況和患者體質而發(fā)生變化。若抗體檢測結果為陰性，說明免疫抑制劑很有效，很好地控制了產(chǎn)生抗體的漿細胞或B細胞。對這些患者，如果我們調(diào)整免疫抑制劑，有些受者抗體會逐漸出現(xiàn)，因為這些患者不產(chǎn)生抗體的原因很可能是免疫抑制劑的作用;但是同時另外一些受者可能永遠不會產(chǎn)生抗體，因為供者的抗原對這些患者來說免疫性不夠強大，或者已經(jīng)誘導了免疫耐受。對后一類患者，我們適當調(diào)整免疫抑制劑，甚至會發(fā)現(xiàn)所謂的“免疫無能(anergy)”，或者稱為“免疫耐受”，這是一個很好的指征，即檢測到陰性結果，可以針對患者的情況相應調(diào)整免疫抑制劑，即所謂的個體化治療。導致過去40年來器官移植受者的生存情況沒有得到改善的原因之一是移植后臨床醫(yī)生對移植受者所采取的治療方案有“惰性”，總是按照國際上或國內(nèi)的標準三聯(lián)治療，而不是有針對性地采取個體化治療?，F(xiàn)在美國非常強調(diào)針對不同患者個體化使用免疫抑制劑，而抗體的監(jiān)測可為個體化治療提供指導。

總之，抗體是引起慢性排斥反應的主要原因，監(jiān)測抗體非常重要，最近幾年來有新的方法對抗體引起的排斥反應進行預防或治療。所有移植臨床醫(yī)生應高度關注并認識到抗體在排斥反應中的作用，對出現(xiàn)的情況及時作出相應的處理和治療調(diào)整，這樣才能很好地控制患者的情況，有助于改善移植器官的長期存活。

1 Patel R，Terasaki PI.Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation［J］.N Engl J Med，1969，280(14):735-739.

2 Cook DJ，Terasaki PI，Iwaki Y，et al.The flow cytometry crossmatch in kidney transplantation［J］.Clin Transpl，1987:409-414.

3 Ogura K，Terasaki PI，Johnson C，et al.The significance of a positive flow cytometry crossmatch test in primary kidney transplantation［J］.Transplantation，1993，56(2):294-298.

4 Terasaki PI，Ozawa M.Predicting kidney graft failure by HLA antibodies:a prospective trial［J］.Am J Transplant，2004，4(3):438-443.

5 Terasaki PI，Ozawa M.Predictive value of HLA antibodies and serum creatinine in chronic rejection:results of a 2-year prospective trial［J］.Transplantation，2005，80(9):1194-1197.

6 Terasaki PI，Ozawa M，Castro R.Four-year follow-up of a prospective trial of HLA and MICA antibodies on kidney graft survival［J］.Am J Transplant，2007，7(2):408-415.

7 Lee PC，Zhu L，Terasaki PI，et al.HLA-specific antibodies developed in the first year posttransplant are predictive of chronic rejection and renal graft loss［J］.Transplantation，2009，88(4):568-574.

8 Lonze BE，Singel AL，Montgomery RA.Eculizumab and renal transplantation in a patient with CAP［J］.N Engl J Med，2010，362(18):1744-1745.