蓮芝消炎膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

林 彤， 成 琳

(廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510160)

蓮芝消炎膠囊由穿心蓮和山芝麻兩味藥材經(jīng)提取制成，具有清熱，解毒，消炎之功效，用于腸胃炎，支氣管炎，扁桃體炎，咽喉炎，肺炎等。該品種為國(guó)家二級(jí)中藥保護(hù)品種，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十二冊(cè)［1］。原標(biāo)準(zhǔn)有山芝麻和穿心蓮的薄層色譜鑒別及采用滴定法測(cè)定穿心蓮總內(nèi)酯的含量。由于含量測(cè)定方法操作繁瑣，專屬性差以及原山芝麻薄層色譜鑒別陰性對(duì)照有干擾等原因，本實(shí)驗(yàn)對(duì)山芝麻和穿心蓮的薄層色譜鑒別及穿心蓮含量測(cè)定方法進(jìn)行了修訂，改用高效液相色譜法測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，有效地控制該品種的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀;二極管陣列檢測(cè)器;Millipore Milli-Q純水器;Mettler Toledo萬(wàn)分之一、十萬(wàn)分之一及百萬(wàn)分之一電子天平。

脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品:(批號(hào):0854-200204，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品:(批號(hào):0797-200106，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。

甲醇為色譜純，水為超純水，中性氧化鋁(層析用，200～300目，上海新誠(chéng)精細(xì)化工有限公司，批號(hào):200108)，其余試劑均為分析純。

蓮芝消炎膠囊(批號(hào):C25076;C27006;C27008;C27009;20050806;20051002;20060101;20060104;050309;051103)，由廣州白云山光華制藥股份有限公司、廣東省惠州九惠制藥廠和廣東省惠州市中藥廠提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 山芝麻 取本品4粒，傾出內(nèi)容物，用60%乙醇10 mL溶解，濾過(guò)，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加入乙酸乙酯振搖提取兩次，每次15 mL，分取乙酸乙酯液，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取山芝麻對(duì)照藥材3g，用60%乙醇50 mL加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(15∶2∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%硫酸鈰的10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱5 min，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。

本次修訂過(guò)程中增加了山芝麻陰性對(duì)照，結(jié)果顯示按原標(biāo)準(zhǔn)方法山芝麻陰性對(duì)照有干擾。參考文獻(xiàn)［2］比較了不同展開(kāi)劑和顯色劑的薄層色譜效果，優(yōu)選出色譜條件如上所述，顯示展開(kāi)效果較好，山芝麻特征斑點(diǎn)Rf值適中，山芝麻陰性對(duì)照無(wú)干擾，供試品薄層色譜中與山芝麻對(duì)照藥材主斑點(diǎn)基本一致，見(jiàn)圖1。

圖1 山芝麻的薄層鑒別色譜圖(修訂后的方法)

2.1.2 穿心蓮 取穿心蓮葉對(duì)照藥材0.5 g，加乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至約5 mL，作為對(duì)照藥材溶液。另取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸?。酆繙y(cè)定］項(xiàng)下的供試品溶液8 μL、對(duì)照藥材溶液8 μL及對(duì)照品溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(4∶3∶0.4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn);噴以2%3，5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-2 mol/L氫氧化鉀溶液(1∶1)混合溶液(臨用時(shí)配制)，立即在日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

參照《中國(guó)藥典》2005年版一部“穿心蓮片”的薄層鑒別方法［3］549-550作了修改，以脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品作對(duì)照，采用穿心蓮葉對(duì)照藥材以增加該鑒別的專屬性。部分供試品溶液在與穿心蓮對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，只顯脫水穿心蓮內(nèi)酯斑點(diǎn)而未顯穿心蓮內(nèi)酯的斑點(diǎn)。這是由于穿心蓮內(nèi)酯對(duì)熱不穩(wěn)定，高溫干燥時(shí)部分轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯［4］，因而采用高溫濃縮干燥(減壓干燥)工藝制得的成品，其供試品薄層色譜中脫水穿心蓮內(nèi)酯斑點(diǎn)清晰而穿心蓮內(nèi)酯斑點(diǎn)不明顯(穿心蓮內(nèi)酯的有無(wú)在HPLC含量測(cè)定中將得到進(jìn)一步確證)，采用低溫干燥(浮化床干燥)工藝則均顯示有脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯斑點(diǎn)。穿心蓮干浸膏陰性對(duì)照無(wú)干擾，薄層色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2 穿心蓮含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含8 μg和50 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，室溫浸泡1 h，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL(剩余濾液供［鑒別］用)，置中性氧化鋁柱(200～300目，3 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖2 穿心蓮的薄層鑒別色譜圖

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:DiamonsilTM鉆石 C18(200 mm × 4.6 mm，5 μm)No:8022889;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:甲醇-水(60 ∶40)，流速:1 mL/min;穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。理論板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000，供試品液相色譜圖見(jiàn)圖3～6。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯HPLC色譜圖

圖4 脫水穿心蓮內(nèi)酯HPLC色譜圖

2.2.4 專屬性 精密稱取缺穿心蓮干浸膏的模擬樣品0.2g，按含量測(cè)定方法制備供試液并進(jìn)行測(cè)定，液相色譜圖見(jiàn)圖6，在與穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，未見(jiàn)有色譜峰，說(shuō)明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定不造成干擾。

圖5 蓮芝消炎膠囊供試液HPLC色譜圖(批號(hào)20060104)

圖6 穿心蓮干浸膏陰性HPLC色譜圖

2.2.5 線性 精密吸取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.15 mg/mL)0.5、1、3 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液①、②和③。精密吸取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液①1、5 μL，對(duì)照品溶液②1、5、10、20、30 μL，對(duì)照品溶液③20、30 μL，進(jìn)樣，依法測(cè)定，以穿心蓮內(nèi)酯的量 C(μg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程:A=2 066 742.98C－1 052.04，r=0.999 997。結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯在0.007 5～1.35 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.05 mg/mL)2、5、10、20、30 μL，進(jìn)樣，依法測(cè)定，以脫水穿心蓮內(nèi)酯的量C(μg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程:A=1 618 179.68C －2 969.27，r=0.999 95。結(jié)果表明脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.1～1.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 耐用性試驗(yàn)

2.2.6.1 提取方法的選擇 參照《中國(guó)藥典》2005版一部“穿心蓮片”［含量測(cè)定］項(xiàng)下的方法，比較“精密量取續(xù)濾液10 mL置中性氧化鋁柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL量瓶中”與“精密量取續(xù)濾液5 mL置中性氧化鋁柱(200～300目，3 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中”所測(cè)得脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯的量，結(jié)果顯示兩種處理方法所得到的結(jié)果差異不大(見(jiàn)表1)，采用后一種方法可節(jié)省吸附劑和洗脫溶劑。在此基礎(chǔ)上再用甲醇20 mL或40%甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中，按含量測(cè)定方法制備供試液并進(jìn)行測(cè)定，未檢出穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯或所得含量極低，不影響定量結(jié)果，說(shuō)明甲醇20 mL可基本洗脫完全，由此確立供試品溶液的制備方法如2.2.2項(xiàng)下方法。吸附劑用量比較見(jiàn)表1。

表1 吸附劑用量的比較

2.2.6.2 色譜柱的考察 方法中分別采用不同品牌的色譜柱測(cè)定樣品，結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，所選用的兩種色譜柱均達(dá)到方法系統(tǒng)適用性的要求，實(shí)際應(yīng)用中還會(huì)使用其他不同品牌的色譜柱，未能一一考察，考慮到部分企業(yè)樣品的色譜圖中脫水穿心蓮內(nèi)酯峰旁還有一小雜質(zhì)峰，柱效降低時(shí)會(huì)并入脫水穿心蓮內(nèi)酯峰內(nèi)，影響定量，因此系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中以脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算理論板數(shù)，定為不得低于6 000。

表2 兩種C18柱比較

2.2.6.3 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(批號(hào):20060104)，在室溫放置0、2、4、6、8、12 h 后分別進(jìn)樣，依法測(cè)定，計(jì)算脫水穿心蓮內(nèi)酯平均含量為0.044 08 mg/mL，RSD 為2.1%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定。

取同一份供試品溶液(批號(hào):20060104)，在室溫放置 0、1、2、3、5、6、8、9、15 h 后分別進(jìn)樣，依法測(cè)定，計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯平均含量為2.598 8 μg/mL，RSD為2.1%(n=9)，表明供試品溶液在15 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào):20060104)樣品，精密稱取6份，按2.2.2項(xiàng)制備供試液并進(jìn)行測(cè)定。脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均含量為27.819 9 mg/g，RSD為2.3%(n=6);穿心蓮內(nèi)酯的平均含量為1.546 8 mg/g，RSD為2.3%(n=6)。

2.2.8 準(zhǔn)確度(以加樣回收率表示) 取已知含量(批號(hào):20060104)的樣品0.1 g，精密稱取6份，各精密加入脫水穿心蓮內(nèi)酯(23.103 mg/200 mL)對(duì)照品溶液25 mL，稱定重量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，平均回收率為99.1%，RSD為2.8%(n=6)。

表3 脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率試驗(yàn)結(jié)果

取已知含量(批號(hào):20060104)的樣品0.1 g，精密稱取7份，各精密加入穿心蓮內(nèi)酯(1.411 mg/200 mL)對(duì)照品溶液25 mL，稱定重量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4，平均回收率為99.8%，RSD為1.9%(n=7)。

表4 穿心蓮內(nèi)酯回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取收集到的10批樣品，每批樣品平行取樣兩份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試液，分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，供試品溶液5～20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定兩次，計(jì)算供試品中脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=4)

3 討論

3.1 從10批樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)可見(jiàn)，不同企業(yè)產(chǎn)品的含量差異較大，部分企業(yè)不同批次的樣品含量差異也較大，分析原因一方面穿心蓮葉藥材的質(zhì)量差異較大，各企業(yè)制備穿心蓮浸膏的設(shè)備不同，使原料中穿心蓮內(nèi)酯的總量差異較大;另一方面處方中穿心蓮總內(nèi)酯量是按穿心蓮干浸膏經(jīng)滴定法測(cè)定穿心蓮總內(nèi)酯的含量，換算成相當(dāng)于穿心蓮總內(nèi)酯60 g投料，測(cè)定方法專屬性不強(qiáng)，滴定終點(diǎn)較難判斷，導(dǎo)致穿心蓮干浸膏投料量不夠準(zhǔn)確，因此有必要建立專屬性強(qiáng)的方法取代滴定法。

3.2 《中國(guó)藥典》2005版一部“穿心蓮”藥材［3］189-190含量測(cè)定是在225 nm波長(zhǎng)下測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯的含量及在254 nm波長(zhǎng)下測(cè)定脫水穿心蓮內(nèi)酯含量，以兩者的總量評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量。由于穿心蓮內(nèi)酯的熱不穩(wěn)定性，“穿心蓮片”制劑含量測(cè)定只在254 nm波長(zhǎng)下測(cè)定脫水穿心蓮的含量。在制定本品種含量方法之初由于所收集的樣品中穿心蓮內(nèi)酯的量較低，與脫水穿心蓮內(nèi)酯含量相差懸殊，因而只測(cè)定了成品中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，隨后收集到部分廠家的樣品及穿心蓮干浸膏，發(fā)現(xiàn)由于采用不同的干燥設(shè)備所得穿心蓮干浸膏中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的比例有很大差異，采用低溫干燥(浮化床干燥)所得穿心蓮干浸膏中穿心蓮內(nèi)酯含量較高，脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量較低，采用高溫濃縮干燥(減壓干燥)則反之。提示穿心蓮內(nèi)酯對(duì)熱不穩(wěn)定，高溫干燥時(shí)部分轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯。因此最后建立同時(shí)測(cè)定脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮內(nèi)酯的含量，以兩者含量之和為評(píng)價(jià)指標(biāo)較為客觀、合理。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑［S］.第十二冊(cè).1997:152.

［2］文東旭，馮 楓.山芝麻的薄層色譜鑒別研究［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2003，25(12):2434-2435.

［3］中國(guó)藥典［S］.一部.2005.

［4］曾惠芳，黃曉丹，蘇子仁，等.試析穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的變異因素［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17(4):299-301.