核苷類似物早期病毒學應答慢性乙型肝炎患者血清sTRAIL水平變化及意義

魏 屏 王 華 曾令蘭 朱 勵 （華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院感染科,武漢 430022）

核苷類似物早期病毒學應答慢性乙型肝炎患者血清sTRAIL水平變化及意義

魏 屏 王 華①曾令蘭①朱 勵②（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院感染科,武漢 430022）

目的:探索核苷類似物早期病毒學應答慢性乙型肝炎患者（CHB）血清sTRAIL水平變化及意義。方法:60例CHB均接受核苷類似物抗病毒藥物治療（拉米夫定或替比夫定）,根據治療24周末HBV DNA水平將患者分為完全病毒學應答組、部分病毒學應答組、無病毒學應答組,設正常對照組。采集治療前、治療4、12、24周末患者的血清,檢測血清sTRAIL水平,同時檢測IFN-γ、ALT水平。結果:患者治療前sTRAIL、IFN-γ及ALT水平均較正常對照組升高（P＜0.05或P＜0.01）。sTRAIL水平在完全應答組治療4周末、部分應答組治療12周末下降。與治療前比,差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,在治療4周末完全應答組sTRAIL水平低于同期部分應答組（P＜0.05）。IFN-γ水平在完全應答組治療4周末、部分應答組治療12周末升高,與治療前比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,但完全應答組IFN-γ水平在治療4周末與同期部分應答組差異無統(tǒng)計學意義。ALT水平在三組的治療過程中均逐步下降,各時間點間差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。完全應答組治療前sTRAIL水平與IFN-γ水平、ALT水平呈正相關（P＜0.01）,治療后sTRAIL水平與IFN-γ水平呈負相關（P＜0.05）。結論:CHB血清sTRAIL水平升高;核苷類似物抗病毒治療早期病毒學應答者血清sTRAIL水平下降,尤其是完全應答者在療程的第4周就有明顯的變化。sTRAIL在CHB免疫損傷中起重要作用,在其核苷類似物抗病毒治療免疫恢復中也起重要作用,可作為核苷類似物治療CHB早期應答指標預測遠期療效。

TRAIL;慢性乙型肝炎;核苷類似物;早期應答

目前應用于臨床的所有不同類型的核苷（酸）類似物均難以達到徹底清除病毒特別是清除共價閉合環(huán)狀 DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）復制模版的作用,因此,乙型肝炎抗病毒治療是一長期過程。早期預測核苷（酸）類似物抗病毒治療的效果,及時調整治療方案,也是核苷（酸）類似物抗病毒治療成敗的關鍵。在2007年美國肝病研究學會（AASLD）年會上,Keeffe教授提出了CHB治療路線圖:根據24周時HBV DNA水平來預測遠期療效和調整治療方案[1],但還有哪些指標可作為早期應答指標預測遠期療效,卻少有報道。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是新近被證實的一個新型凋亡分子,廣泛表達于多種組織和細胞,對正常生理狀態(tài)下的機體組織沒有毒性,而在病理狀態(tài)下被激活參與機體的免疫反應,TRAIL被認為是機體的一個典型的免疫監(jiān)視分子[2,3]。本研究對核苷類似物抗病毒治療早期出現(xiàn)病毒學應答的慢性乙型肝炎患者（CHB）血清sTRA IL水平進行了動態(tài)檢測,同時還檢測了γ-干擾素（Interferon-γ,IFN-γ）,丙氨酸氨基轉換酶（Alanine amino transferase,ALT）,并進行相關分析,以探討核苷類似物早期病毒學應答CHB血清sTRAIL水平變化及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 病人來自2006～2008年本院接受核苷類似物抗病毒治療CHB,患者服用拉米夫定或替比夫定（拉米夫定100mg/d,替比夫定600mg/d）,據治療24周末HBV DNA水平將患者分為完全病毒學應答組、部分病毒學應答組、無病毒學應答組,各組隨機抽選20名患者,共60例。其中男55例,女5例,年齡18～70歲。診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案[4]。均為初治患者,治療前血清 HBV DNA＞105,ALT≥2×ULN。并同時排除HCV、HAV、HEV及其它原因所致的肝損傷。健康獻血員10例作為正常對照。

1.2 檢測方法

1.2.1 血清采集與保存 采集治療前、治療4、12、24周末患者的血清,肝功能、HBV DNA及時檢測,另血清-80℃凍存,統(tǒng)一檢測sTRAIL和IFN-γ。

1.2.2 檢測方法及試劑和儀器 sTRAIL檢測的ELISA試劑盒系美國Invitrogen公司產。sTRAIL的測定將標準品按 3 000、1 500、750、375、187.5、93.7、46.8 pg/m l配制。除空白孔（第一孔）外,將標準品100μl加入相應孔內,樣本用樣本稀釋液1∶2稀釋后每孔100μl,依次加入反應孔中,酶標板加上封板膠,36℃放置90分鐘后洗滌5次。除空白孔外,將配制好的生物素化抗體每孔加入100μl,酶標板加上封板膠,36℃放置60分鐘后洗滌5次。除空白孔外,將配制好的酶結合物（避光室溫放置）每孔加入100μl,酶標板加上封板膠,36℃避光放置30分鐘后洗滌5次。每孔加入100μl顯色液36℃放置15分鐘,每孔加入100μl終止液。在酶標儀上讀取A450值,并繪制標準曲線,根據標準曲線得出待測血清中sTRAIL的表達量。IFN-γ檢測的ELISA試劑盒購自深圳晶美生物有限公司。HBV DNA定量檢測采用PCR檢測法,Roche lightcycler分析儀,深圳匹基公司試劑。ALT檢測采用全自動生化分析儀檢測。各試劑盒均嚴格按照說明書進行。

1.3 療效評定標準 以治療24周末HBV DNA的水平將患者分為完全病毒學應答（HBV DNA＜500 copies/ml）、部分病毒學應答（HBV DNA 500～104copies/ml）和無應答（HBV DNA＞104copies/ml）等3組。

2 結果

各組sTRAIL、IFN-γ、ALT水平在治療過程中的變化見表1、2、3?；颊咧委熐?sTRAIL、IFN-γ及ALT水平均較正常對照組升高（P＜0.05或P＜0.01）,差異均有統(tǒng)計學意義。療程中各組sTRAIL水平的變化:完全應答組治療4周末、部分應答組治療12周末下降,與治療前比明顯降低（P＜0.05）,差異均有統(tǒng)計學意義;無應答組則無明顯變化;在治療4周末完全應答組sTRAIL水平低于同期部分應答組（P＜0.05）。療程中各組IFN-γ水平的變化:完全應答組治療4周末、部分應答組治療12周末升高,與治療前相比明顯升高（P＜0.05）,差異均有統(tǒng)計學意義;在治療4周末完全應答組IFN-γ水平與同期部分應答組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;無應答組雖然在療程中逐漸升高,但各時間點間無明顯差異。療程中各組ALT水平均逐步下降,各時間點間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,完全應答組在12周末達正常范圍,部分應答組在24周末達正常范圍,無應答組24周末仍高于正常范圍。相關性分析顯示,完全應答組治療前sTRAIL水平與IFN-γ水平、ALT水平呈正相關（r=0.598、r=0.586,P均＜0.01）,治療后sTRAIL水平與IFN-γ水平呈負相關（r=-0.457,P＜0.05）。

表1 各組sTRAIL在治療過程中的變化（pg/ml,±s）Tab.1 The sTRAIL level of each group at each stage（pg/m l,±s）

表1 各組sTRAIL在治療過程中的變化（pg/ml,±s）Tab.1 The sTRAIL level of each group at each stage（pg/m l,±s）

Note:vs normal,1）P＜0.01;vsbefore therapy at same group,2）P＜0.05;vs partial at same time,3）P＜0.05.

Groups n Before therapy 4 weeks after therapy 12weeks after therapy 24 weeksafter therapy Normal 10 217.2±87.85 — — —Complete 20 1 312.50±390.681） 847.96±433.472）3） 856.05±310.292） 977.83±264.632）Partial 20 1 353.14±558.561） 1 383.60±644.47 910.32±375.422） 994.03±312.432）No 20 1 343.01±583.041） 1 250.75±456.06 1 399.08±664.13 1 255.16±457.17

表2 各組IFN-γ在治療過程中的變化（ng/L,±s）Tab.2 The IFN-γlevelof each group at each stage（ng/L,±s）

表2 各組IFN-γ在治療過程中的變化（ng/L,±s）Tab.2 The IFN-γlevelof each group at each stage（ng/L,±s）

Note:vs normal,1）P＜0.05;vsbefore therapy at same group,2）P＜0.05.

Groups n Before therapy 4 weeks after therapy 12weeks after therapy 24 weeksafter therapy Normal 10 4.44±1.28 — — —Complete 20 6.93±2.801） 8.66±2.372） 9.20±1.602） 9.20±1.872）Partial 20 6.44±2.621） 7.35±2.70 8.7±2.632） 8.92±2.572）No 20 6.17±2.121） 6.62±2.59 6.80±1.97 7.39±2.34

表3 各組ALT在治療過程中的變化（U/L,±s）Tab.3 The ALT levelof each group ateach stage（U/L,±s）

表3 各組ALT在治療過程中的變化（U/L,±s）Tab.3 The ALT levelof each group ateach stage（U/L,±s）

Note:vs normal,1）P＜0.01;vsbefore therapy,2）P＜0.05;vs4 weeksafter therapy,3）P＜0.05;vs 12 weeksafter therapy,4）P＜0.05.

Groups n Before therapy 4 weeks after therapy 12weeks after therapy 24 weeksafter therapy Normal 10 28.20±8.47 — — —Complete 20 182.75±98.421） 97.95±69.302） 41.05±19.723） 35.20±22.624）Partial 20 176.00±79.161） 108.75±62.072） 55.50±28.133） 33.25±16.224）No 20 163.10±90.401） 104.40±63.952） 70.70±58.763） 63.95±43.344）

3 討論

考核慢性乙型肝炎的治療效果,目前HBV DNA是公認的最佳指標,HBV DNA下降情況直接反映了患者對抗病毒藥物的應答情況。但僅僅HBV DNA下降不是慢性乙肝的治療目標。EASL2009慢乙肝指南提出了不同的治療終點:使HBV DNA持續(xù)陰性是最基本的治療目標,HBeAg血清轉換乃至HBsAg消失或甚至產生HBsAb血清轉換才是理想的治療終點。而只有通過機體免疫恢復或增強,才能促使并維持HBeg/HBeAb血清轉換,甚至產生HBsAg/HBsAb血清轉換,直至完全清除HBV。TRAIL作為機體的一個典型的免疫監(jiān)視分子,它于1995年Wiley等[5]首次發(fā)現(xiàn)并克隆成功,為繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第三個TNF超家族的凋亡分子。TRAIL誘導細胞凋亡的調控主要是通過嚴格的受體表達來實現(xiàn)的[6,7]。2003年Mundt等[8]在腺病毒感染鼠肝炎模型中發(fā)現(xiàn),病毒感染可激活TRAIL并誘導細胞凋亡,推測TRAIL誘導細胞凋亡可能在病毒性肝炎中發(fā)揮重要作用。Han等[9]檢測HBV感染患者血清,發(fā)現(xiàn)sTRAIL水平與疾病狀態(tài)和病情輕重密切相關,也認為sTRAIL參與了病毒感染的肝細胞凋亡。有體外實驗報道TRAIL系統(tǒng)參與了乙型肝炎患者外周血淋巴細胞活化誘導細胞死亡（activation induced celldeath,AICD）的過程,其中TRAIL-R2與TRAIL-R3可能起主要調控作用[10]。IFN-γ是病毒感染激活機體的免疫系統(tǒng)后釋放的非常重要的細胞因子,實驗證明IFN-γ可以促進淋巴細胞及單核細胞等炎性細胞TRAIL的表達及sTRAIL的釋放[11,12]。本實驗對核苷類似物抗病毒治療早期出現(xiàn)病毒學應答的CHB血清sTRAIL水平進行了動態(tài)檢測,同時還檢測了IFN-γ、ALT,并進行相關分析。結果表明,CHB血清中sTRAIL、IFN-γ、ALT水平較正常人明顯升高,說明sTRAIL在IFN-γ的作用下,一方面能夠及時清除突變細胞和轉化細胞;另一方面sTRAIL在殺傷靶細胞的同時也有可能進一步加劇肝臟的損傷,sTRAIL介導的細胞凋亡是肝細胞損傷的重要機制之一。結果還顯示,核苷類似物抗病毒治療24周病毒學應答者,sTRAIL水平降低,IFN-γ水平提高,ALT恢復正常,sTRAIL水平與IFN-γ水平、ALT水平具有直線相關性,也說明可能隨著治療后病毒載量下降,TRAIL及TRAIL-R表達減少或消失,sTRAIL介導的細胞凋亡受到遏制,尤其是淋巴細胞AICD受到遏制,淋巴細胞功能恢復正常,提高了機體的特異性免疫反應,進一步有利于病毒的清除,即sTRAIL在其免疫恢復中也起重要作用。國內也有學者報道核苷類似物抗病毒治療能使機體免疫部分恢復或增強[13]。結果還發(fā)現(xiàn)核苷類似物抗病毒治療24周,出現(xiàn)病毒學完全應答者,在療程的第4周末sTRAIL水平就明顯下降,提示sTRAIL可能較其它指標更敏感地反映患者的免疫功能恢復情況及治療效果,也提示根據早期的sTRAIL變化能預測遠期療效和調整治療方案。

總之,本研究結果部分證實了sTRAIL在HBV感染所致免疫損傷中扮演重要角色,同時作為是機體的一個典型的免疫監(jiān)視分子,通過sTRAIL水平的變化了解核苷類似物抗病毒治療早期患者免疫恢復或增強情況,以最終達到HBeAg血清轉換,甚至HBsAg血清轉換。sTRAIL有可能作為核苷類似物治療早期應答指標預測遠期療效。然而,核苷類似物抗乙肝病毒免疫效應機制是復雜的,關于TRAIL在其中的作用還需要進一步深入研究,如對膜表面TRAIL（mTRAIL）的研究、對TRAIL受體（TRAIL-R）的研究、TRAIL與HBeAg血清轉換及HBsAg血清轉換的相關研究等,以利充分發(fā)揮TRAIL的免疫監(jiān)視作用,使抗病毒治療能達到理想的治療終點。

1 Keeffe E B,Zeuzem S,Koff RSetal.Report of an international workshop:Roadmap for management of patients receiving oral therapy for chronic hepatitis B[J].Clin GastroenterolHepatol,2007;5:890-897.

2 Strater J,Moller P.TRA IL and viral infection[J].Vitam Horm,2004;67:257-274.

3 Kamohara H,Matsuyama W,Shimozato Oetal.Regulation of tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）and TRAIL receptor expression in human neutrophils[J].Immunology,2004;111（2）:186-194.

4 寄生蟲病學分會肝病分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志,2000;8（6）:324-329.

5 W iley SR,Schooley K,Smolak P Jetal.Identification and characterization and characterization of a new member of the TNF fam ily that induces apoptosis[J].Immunity,1995;3（6）:673-682.

6 Thorburn A.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）pathway signaling[J].JThorac Oncol,2007;2（6）:461-465.

7 Falschlehner C,Emmerich C H,Gerlach Betal.TRAIL signalling:decisions between life and death[J].Int JBiochem CellBiol,2007;39（7-8）:1462-1475.

8 Mundt B,Kuhnel F,Zender Letal.Involvement of TRAILand its receptors in viral hepatitis[J].FASEB J,2003;17（1）:94-96.

9 Han L H,Sun W S,Ma C Hetal.Detection of soluble TRAIL in HBV infected patients and its clinical implications[J].World JGastroenterol,2002;8（6）:1077-1080.

10 劉征波,范學工,胡國齡.TRA IL及TRAIL受體在慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細胞的表達[J].中華微生物學和免疫學雜志,2004;24（11）:897-900.

11 HalaasO,Vik R,AshkenaziAetal.Lipopolysaccharide inducesexpression of APO2 Ligand/TRAIL in humanmonocytesandmacrophages[J].Scand J Immunol,2000;51（3）:244-250.

12 Shin EC,Ahn JM,Kim CHetal.IFN-gamma iduces cell death in human hepatoma cells through a TRAIL/death receptor-mediated apoptotie pathway[J].Int JCancer,2001;93（2）:262-268.

13 江 軍,繆曉輝,蔡 雄.阿德福韋酯和拉米夫定對慢性乙型肝炎患者IFN-γ和IL-4的影響比較[J].臨床肝膽病雜志,2007;23（3）:176-178.

[收稿2009-07-02 修回2009-11-04]

（編輯 倪 鵬）

The study of the sera TRAIL levels in chronic hepatitis B patients treated w ith Nucleoside analogues

WEIPing,WANGHua,ZENGLing-Lan,ZHULi.InstituteofInfectiousDiseases,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

Objective:To study the sTRAIL levels in chronic hepatitis B（CHB）patients upon nucleoside analogues therapy.Methods:Serial seraof60 CHB patients before and after nucleoside analogues therapy were collected,among which there were 20 complete responding cases,20 partial responding cases,20 non-responding cases,and 10 healthy people.The level of sTRAIL,IFN-γand ALT were detected.Results:The level of sTRAIL,IFN-γand ALT of CHB patientswere higher than thatof normal group.The sTRAIL level of complete responding group at4weeks and partial responding group at 12 weekswere lower than those before therapy,while serum TRAIL of comp lete responding groupwere lower than those of partial responding group at4 weeks.The IFN-γlevel of complete responding group at4 weeks and partial responding group at12 weekswere higher than those before therapy.ALT levels ofallgroupsin the courseof therapy declined gradually and significant difference was observed atdifferent time point.Conclusion:Serum TRAIL level can beused as an earlymarker for efficacy of nucleoside analogues therapy efficacy in CHBpatients.sTRAILmay play a role in restoring immune injury of early anti-viral response in patientswith hepatitis B.

sTRAIL;Chronic hepatitis B;Nucleoside;Early anti-viral response

R512.6+2

A

1000-484X（2010）02-0174-04

①華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院傳染病實驗室,武漢430022

②華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中心實驗室,武漢 430022

魏 屏（1958年-）,女,副教授,主要從事傳染病研究。

·實用臨床免疫學·