人喉癌長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性①

尹萬(wàn)忠 王 蘋(píng) 祝 威 （吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,長(zhǎng)春 130021）

人喉癌長(zhǎng)春新堿耐藥細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性①

尹萬(wàn)忠 王 蘋(píng) 祝 威 （吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,長(zhǎng)春 130021）

目的:建立人喉癌長(zhǎng)春新堿多藥耐藥細(xì)胞系。方法:以藥物濃度梯度遞增法誘導(dǎo)篩選人喉癌Hep-2的多藥耐藥細(xì)胞株Hep-2/v,比較兩組細(xì)胞的形態(tài)和倍增時(shí)間;MTT法確定細(xì)胞的IC50及其耐藥指數(shù);流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞內(nèi)的羅丹明聚集情況;實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)MDR1基因的mRNA表達(dá),Western blot法檢測(cè)相應(yīng)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:建成的Hep-2/v耐藥細(xì)胞株,其耐藥性能穩(wěn)定,耐藥指數(shù)為45,并與順鉑及5-氟尿嘧啶有不同程度的交叉耐藥性;Hep-2/v的體外群體細(xì)胞倍增時(shí)間較親代細(xì)胞延長(zhǎng)13.58小時(shí);細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示其G0/G1期細(xì)胞升高,而S期細(xì)胞則明顯降低（P＜0.05）;羅丹明染色顯示,Hep-2細(xì)胞內(nèi)的羅丹明較Hep-2/v明顯升高（P＜0.01）;Hep-2/v細(xì)胞MDR1表達(dá)在基因及蛋白水平明顯高于Hep-2細(xì)胞（P＜0.01）。結(jié)論:Hep-2/v細(xì)胞株具有明確及穩(wěn)定的多藥耐藥性,是研究多藥耐藥機(jī)制及篩選逆轉(zhuǎn)劑的良好模型。

喉腫瘤;長(zhǎng)春新堿;多藥耐藥

腫瘤的多藥耐藥性（Multidrug resistance,MDR）是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí),對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理完全不同的其它多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性,多藥耐藥性已成為化療失敗的重要原因之一,因此逆轉(zhuǎn)MDR成為腫瘤研究中的重要課題。而建立多藥耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤多藥耐藥性的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用長(zhǎng)春新堿,以藥物濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立人喉癌多藥耐藥細(xì)胞系,以進(jìn)一步研究腫瘤的多藥耐藥性及逆轉(zhuǎn)治療。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人喉癌Hep-2細(xì)胞系由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 長(zhǎng)春新堿（VCR）、順鉑（DDP）、二甲基四氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）及Rhodmine123購(gòu)自Sigma公司;5-氟尿嘧啶（5-Fu）購(gòu)自Lic公司;RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清及胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen公司;MDR1抗體購(gòu)自Chem icon公司;PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自CapitalBio公司,實(shí)驗(yàn)中所有引物均在Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人喉癌Hep-2細(xì)胞加入培養(yǎng)液為含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/m l的RPM I1640培養(yǎng)液中,置 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞多藥耐藥性的誘導(dǎo) 篩選藥物為VCR,以喉癌Hep-2細(xì)胞為親本細(xì)胞,采用藥物濃度梯度遞增法誘導(dǎo)篩選耐藥細(xì)胞。首先用MTT法測(cè)定VCR對(duì)喉癌親本細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.04 μmol/L。首次加藥濃度為0.02μmol/L VCR,待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代后,逐步提高藥物的濃度,歷時(shí)12個(gè)月后,細(xì)胞可在0.96μmol/L濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)。MTT法測(cè)定IC50為1.8μmol/L,誘導(dǎo)篩選的耐藥細(xì)胞株命名為Hep-2/v。

1.2.3 MTT法測(cè)定藥物的敏感性 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2及Hep-2/v細(xì)胞,調(diào)整密度為5×104m l-1,接種于96孔板,每孔100μl,再分別加入長(zhǎng)春新堿、順鉑及5-氟尿嘧啶3種化療藥物,每孔總體積200 μl,每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)倍比濃度梯度,一個(gè)空白對(duì)照,各種藥物濃度作3個(gè)平行孔,培育72小時(shí)后,每孔加入5mg/ml的MTT 20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),每孔加200 μl DMSO,以490 nm檢測(cè)波長(zhǎng),測(cè)定各孔的光密度值（A 值）,計(jì)算IC50和RI:按抑制率=（1-加藥組A值/細(xì)胞對(duì)照組A值）×100%計(jì)算每一種濃度的抑制率,并根據(jù)直線回歸法計(jì)算各種抗癌藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）及耐藥指數(shù)（RI）,RI=IC50（耐藥細(xì)胞）/IC50（親本細(xì)胞）。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的繪制、倍增時(shí)間測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)整密度為 5×104m l-1,取2m l細(xì)胞懸液接種至24孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每日取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算均值,連續(xù)觀察7日,繪制生長(zhǎng)曲線,按Patterson公式[1]計(jì)算群體倍增時(shí)間（Doub ling time,TD）,TD=T×log 2/（logNt-logNo）,No:初始細(xì)胞數(shù),Nt:終末細(xì)胞數(shù),T:Nt-No時(shí)間。倒置顯微鏡下觀察耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞內(nèi)羅丹明的蓄積變化 取含1×106m l-1細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,800 r/min離心5分鐘后棄去培養(yǎng)基,加入300μl含5%新生牛血清的PBS和700μl無(wú)水乙醇,-20℃放置24小時(shí),離心去上清,1m l PBS清洗離心,去上清后加入1mg/m l的RNaseA 100μl,37℃水浴30分鐘,加入100μg/ml的碘化丙啶（PI）300μl,暗處放置20分鐘后以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

取1 ml含2×106個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,加入5 mmol/L的羅丹明2.5μl,37℃保溫30分鐘,800 r/min離心5分鐘,棄去培養(yǎng)液,以新鮮培養(yǎng)液洗去細(xì)胞外的羅丹明染料,37℃保溫10分鐘,再以新鮮培養(yǎng)基洗滌一次,細(xì)胞重懸于預(yù)冷的培養(yǎng)基,在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的羅丹明蓄積。

1.2.6 Hep-2和Hep-2/v MDR1基因的mRNA及蛋白表達(dá) RT-PCR法檢測(cè)MDR1的表達(dá):用TRIzol提取Hep-2和Hep-2/v細(xì)胞的總RNA,紫外光分光光度計(jì)定量RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程用Oligo（dT）15法:總RNA 2μg,5×1stBuffer 4μl,DNTPs 1 μl,Oligo（dT）15 2μl,0.1mol/L DTT 2μl,RNase Inhibitor 0.5 μl,M-MLV 1μl加入 DEPC 水至20μl。反轉(zhuǎn)錄條件為25℃10分鐘,37℃1小時(shí),4℃終止。MDR1引物 :Forward 5′-GCACTAAAGTAGGAGACAAAGGAA-3′,Reverse 5′-TGACTCTGCCATTCTGAAACAC-3′。Actin 引物 :Forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,Reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。PCR 反應(yīng)體系包括:cDNA 1μl,引物1.2μl,2×PCR Buffer for EvaGreen 10μl,20×EvaGreen染料0.6μl,Cap Taq酶0.3μl,Nuclease-Free H2O to 20 μl。反應(yīng)條件為95℃5分鐘,95℃15秒,60℃15秒,72℃20秒,76℃3秒,共40個(gè)循環(huán)。以人Actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)的特異性通過(guò)產(chǎn)物熔解曲線進(jìn)行確認(rèn),mRNA的相對(duì)含量根據(jù)公式 Fold change=2-Δ（ΔCt）計(jì)算 。

Western blot檢測(cè)MDR1:用蛋白裂解液于冰上裂解Hep-2和Hep-2/v 30分鐘,4℃12 000×g離心40分鐘,取上清-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?上清用 Bradford法測(cè)定蛋白濃度,樣品95℃變性5分鐘后,每孔上樣60 μg,SDS-PAGE（5%stacking gel,8%separating gel）電泳80伏2小時(shí)轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上,用4%脫脂奶粉/TBST室溫下封閉抗原1.5小時(shí)。一抗用4%脫脂奶粉/TBST稀釋后4℃孵育PVDF膜過(guò)夜（MDR1 1∶400,Mouse anti Human,Chemicon international INC）。TBST洗膜三次,每次10分鐘,然后加入二抗,室溫下?lián)u床孵育1小時(shí),再次TBST洗膜三次,每次10分鐘。ECL曝光顯影。圖像分析儀定量分析表達(dá)蛋白的光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行多組比較方差分析。計(jì)量資料用±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 多藥耐藥的檢測(cè)結(jié)果 Hep-2和Hep-2/v細(xì)胞的多藥耐藥情況,見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞的倍增時(shí)間為（28.75±1.12）小時(shí)和（42.33±1.76）小時(shí),耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)較親本細(xì)胞減慢,細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)13.58小時(shí),兩者相比差異顯著（P＜0.05）。光鏡下耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng),Hep-2/v細(xì)胞胞體變大變圓,細(xì)胞內(nèi)的顆粒增多,細(xì)胞常呈分片聚集,貼壁能力較親本細(xì)胞減弱。見(jiàn)圖1。

2.3 細(xì)胞周期及細(xì)胞內(nèi)羅丹明的蓄積變化 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示Hep-2/v細(xì)胞較Hep-2細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞升高（P＜0.05）;而S期細(xì)胞則明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep-2和Hep-2/v細(xì)胞羅丹明的陽(yáng)性百分比為（95.97±0.56）%及（12.40±0.44）%。Hep-2細(xì)胞的羅丹明陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于Hep-2/v細(xì)胞（P＜0.01）。

2.4 Hep-2和Hep-2/v MDR1基因的mRNA及蛋白表達(dá)變化 RT-PCR結(jié)果用2-△△CT方法分析,Hep-2/v細(xì)胞MDR1/Actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量是Hep-2細(xì)胞的（9.61±6.14）倍（P＜0.01）。

Western blot結(jié)果表明MDR1/P-gp在Hep-2/v細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)比Hep-2細(xì)胞明顯增高（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

表1 Hep-2和Hep-2/v細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的耐藥指數(shù)（n=3）Tab.1 RI of Hep-2 and Hep-2/v cells in different drugs（n=3）

圖1 Hep-2及Hep-2/v細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Themorphologica l of Hep-2 and Hep-2/v cells

表2 Hep-2和Hep-2/v的細(xì)胞周期分布（n=3）Tab.2 The cell cycle distribution of Hep-2 and Hep-2/v cells（n=3）

圖2 Hep-2及Hep-2/v細(xì)胞的MDR1/P-gp的蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of MDR1/P-gp protein in Hep-2 and Hep-2/v cells

3 討論

喉癌在頭頸部是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,目前仍是以手術(shù)為主的綜合治療,而化療作為綜合治療的重要手段,可以抑制腫瘤細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移和殺傷殘存的癌細(xì)胞,降低手術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),但由于多藥耐藥的產(chǎn)生,化療的療效欠佳,因此研究喉癌的多藥耐藥及逆轉(zhuǎn)機(jī)制是臨床面臨的主要問(wèn)題,而在體外建立多藥耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的重要手段[2,3]。目前國(guó)內(nèi)外建立腫瘤MDR細(xì)胞系的方法通常是采用藥物濃度遞增持續(xù)法和大劑量間歇誘導(dǎo)法[4],而采用藥物濃度遞增法建立的耐藥細(xì)胞系的主要優(yōu)點(diǎn)是耐藥性穩(wěn)定、可靠。本研究以長(zhǎng)春新堿為誘導(dǎo)劑,采用藥物濃度遞增法歷時(shí)12個(gè)月誘導(dǎo)建立了喉癌多藥耐藥細(xì)胞系Hep-2/v,Hep-2/v細(xì)胞對(duì)VCR的耐藥性為Hep-2細(xì)胞的45倍,而且經(jīng)MTT檢測(cè)該細(xì)胞系對(duì)5-Fu、DDP等結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的抗癌藥也產(chǎn)生了不同程度的耐藥性,說(shuō)明Hep-2/v具有MDR特性,是研究喉癌耐藥性及篩選逆轉(zhuǎn)劑的理想模型。

長(zhǎng)春新堿的抗腫瘤作用主要是抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成,使有絲分裂停止于中期,并且本研究的細(xì)胞周期分布分析結(jié)果中亦顯示Hep-2/v細(xì)胞與Hep-2細(xì)胞相比G0/G1期細(xì)胞的比例升高,S期細(xì)胞比例降低,這可能是耐藥細(xì)胞株生長(zhǎng)速度變慢的原因,這種現(xiàn)象在其它的耐藥細(xì)胞研究中也有發(fā)生[5]。另外本研究通過(guò)對(duì)Hep-2及Hep-2/v細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制并計(jì)算倍增時(shí)間發(fā)現(xiàn)Hep-2/v倍增時(shí)間較親本細(xì)胞延長(zhǎng)了13.58小時(shí),Hep-2/v細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度明顯減慢。而腫瘤的倍增時(shí)間越長(zhǎng),對(duì)化療藥物的敏感性亦降低[6]。

喉癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜,癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡抑制基因及一些細(xì)胞因子等都可能參與耐藥的形成,而藥物外排機(jī)制占相當(dāng)大的比率,它是由MDR1基因編碼的一種能量依賴性藥物排除泵,與抗癌藥物結(jié)合后再結(jié)合ATP由ATP供能將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵到細(xì)胞外,使藥物濃度不斷降低,從而產(chǎn)生耐藥性[7,8]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep-2和Hep-2/v細(xì)胞羅丹明的蓄積情況,顯示Hep-2細(xì)胞的羅丹明陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于Hep-2/v細(xì)胞,表明Hep-2/v細(xì)胞的耐藥機(jī)制確實(shí)是由于MDR1基因編碼的P-gp蛋白所致。另外本研究利用RT-PCR及Westernblot分別在基因及蛋白質(zhì)水平檢測(cè)Hep-2和Hep-2/v細(xì)胞中MDR1/P-gp的表達(dá)情況,結(jié)果再次證實(shí)Hep-2和Hep-2/v兩者間MDR1/P-gp表達(dá)的顯著差異。因此我們認(rèn)為對(duì)喉癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)研究可放在抑制或阻斷MDR1/P-gp的表達(dá)上。

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[收稿2009-11-21]

（編輯 張曉舟）

Establishment of a multid rug resistance cell line from human laryngeal cancer cells and itsbiologic features

YINWan-Zhong,WANGPing,ZHUWei.DepartmentofOtorhinol-AryngologyandHead-NeckSurgery,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To estab lish amu ltidrug resistance cell line from human laryngeal cancer cells by VCR.Methods:Human laryngeal cancercells（Hep-2）wereexposed in stepwise escalating concentration of VCR until the resistant cell（Hep-2/v）linewas developed.The IC50 and the resistance folds ofmu ltidrug resistancewere detected with MTT assay.The differences of cell cycle distribution and Rhodamine accumu lation between Hep-2 and Hep-2/v cellswere studied through flow cytometry.TheMDR1 genewere detected through real-time quantitative RT-PCR,and the corresponding proteinwas detected through western blot.Results:Hep-2/v cellswas established,which had stable resistance to VCR and a resistance index of 45;Hep-2/v cells exhibited cross resistance tomany other chemotherapeutic agents and its doubling timewas prolonged;The numberof cells in G0/G1phase was increased while in S phase decreased（P＜0.05）;Rhodamine accumu lation in Hep-2 cellswasmuchmore than Hep-2/v cells（P＜0.01）;The expression ofMDR1 were increased than that of Hep-2 cells（P＜0.01）.Conclusion:Hep-2/v cell line shows the typicalmultidrug resistance phenotype.It can be served as amodel for the study ofMDR.

Laryngealneoplasms;Vincristine;Multidrug resistance

R739.65

A

1000-484X（2010）02-0129-04

①本文受教育部博士點(diǎn)基金課題資助（20060183040）

尹萬(wàn)忠（1970年-）,男,在讀博士,副教授,主要從事喉癌多藥耐藥研究,E-mail:yinwanzhong88@hotmail.com;

及指導(dǎo)教師:祝 威（1955年-）,女,教授,博士生導(dǎo)師,耳鼻咽喉-頭頸外科主任,主要從事頭頸腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究,E-mail:zhuwei3000@yahoo.com.cn。

·中醫(yī)中藥與免疫·