雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)MSC分泌細(xì)胞因子影響其對(duì)DC成熟與功能的抑制①

趙葉琳 趙曉寅 孫凌云 侯亞義 （南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,南京 210093）

雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)MSC分泌細(xì)胞因子影響其對(duì)DC成熟與功能的抑制①

趙葉琳 趙曉寅 孫凌云②侯亞義 （南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,南京 210093）

目的:本研究試圖檢測(cè)不同濃度17β-雌二醇（E2）存在的情況下人胎肺間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）增殖和表型的變化,并分析這種狀態(tài)的MSC對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）成熟和功能影響及其可能的機(jī)制。方法:分離培養(yǎng)人胎肺MSC,加入不同濃度E2,在24小時(shí)后對(duì)MSC進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、測(cè)定其增殖和貼壁能力,并用流式細(xì)胞儀分析MSC表面標(biāo)志,RT-PCR測(cè)定MSC中細(xì)胞因子（IL-6、TGF-β和VEGF）mRNA的表達(dá)情況。進(jìn)一步探討了E2處理24小時(shí)后的MSC對(duì)DC成熟和功能的影響。結(jié)果:分離得到的MSC純度達(dá)到95%以上;E2影響MSC的增殖和貼壁能力,但不影響MSC表面標(biāo)記的表達(dá);MSC與DC共培養(yǎng)后DC表面CD86、MHCⅡ和CD80的表達(dá)均有所降低,而當(dāng)DC與經(jīng)E2預(yù)處理過(guò)的MSC共培后,DC表面MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)回升;高濃度E2作用MSC 24小時(shí)后,MSC表達(dá)的TGF-β與對(duì)照組相比減少,而 IL-6和VEGF與對(duì)照組相比增加。結(jié)論:E2可能通過(guò)調(diào)節(jié)MSC分泌細(xì)胞因子的水平,改變MSC對(duì)DC的免疫抑制作用。

雌激素;間充質(zhì)干細(xì)胞;樹(shù)突狀細(xì)胞;系統(tǒng)性紅斑狼瘡

雌激素與許多自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān),比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)病表現(xiàn)出明顯的女性優(yōu)勢(shì),尤其易發(fā)于育齡女性,并在妊娠末期,女性體內(nèi)雌激素達(dá)到峰值時(shí),病情嚴(yán)重惡化[1]。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是最重要的專職抗原遞呈細(xì)胞,在免疫應(yīng)答的發(fā)生和外周免疫耐受的維持等方面發(fā)揮著重要的作用。許多證據(jù)表明,DC參與自身免疫性疾病的病理發(fā)生[2],在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者中,DC遞呈自身dsDNA,激活T細(xì)胞[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）表型為 CD29、CD44和 CD105陽(yáng)性,CD31、CD45和CD117陰性,具有多向分化、造血支持及免疫調(diào)節(jié)作用[4]。許多證據(jù)表明,MSC可抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、DC和自然殺傷（NK）細(xì)胞的功能[5-9]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),正常人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）移植到狼瘡模型（MRL）小鼠中后,能改善MRL小鼠的腎臟病變,并減少M(fèi)RL鼠腎臟中TGF-β和VEGF的表達(dá)以及C3免疫復(fù)合物的沉積;正常人MSC移植到SLE患者體內(nèi)也能緩解其病情[10,11]。一些研究表明,MSC能通過(guò)對(duì)DC成熟狀態(tài)的影響而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,并通過(guò)影響DC的分化格局,間接的導(dǎo)致T細(xì)胞的分化無(wú)能或者抑制Th1細(xì)胞方向的分化和促進(jìn)Th2方向的分化[5,6,12,13]?？墒?在體內(nèi)MSC與DC所處的微環(huán)境十分復(fù)雜,MSC對(duì)DC的作用受各種因素影響,在SLE發(fā)病過(guò)程中患者外周血中E2濃度明顯高于正常人。雖然有研究顯示E2能促進(jìn)MSC的增殖,并能促進(jìn)MSC對(duì)局部缺血后的心肌修復(fù)[14,15]。但是在E2的存在下,MSC還會(huì)發(fā)生怎樣的改變呢?E2作用下的MSC對(duì)DC的抑制能力如何呢?關(guān)于這方面還未有報(bào)道。因此,本研究試圖檢測(cè)不同濃度E2存在的情況下MSC增殖和表型的變化,并分析這種狀態(tài)的MSC對(duì)DC成熟和功能影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 水囊引產(chǎn)的12～18周胎兒,獲自于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院。所用材料均嚴(yán)格遵守醫(yī)學(xué)倫理道德,經(jīng)產(chǎn)婦及家屬認(rèn)可,并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。6～8周C57BL/6雌性小鼠,均購(gòu)于江蘇省揚(yáng)州大學(xué)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在24℃,12小時(shí)亮/暗光照周期的濕度控制設(shè)施中,并讓其自由攝取水和食物。細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Costar公司）;DMEM/F12培養(yǎng)基和優(yōu)級(jí)胎牛血清（Gibco公司）;小鼠抗 人 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45和APC-CD105單克隆抗體（ebioscience公司）;rmGM-CSF、rm IL-4（biosource公司）;新生小牛血清（四季青）;兔抗小鼠PE-CD11c、Alexa Flour-CD11c、FITC-CD80、FITC-CD86和 APC-MHCⅡ單克隆抗體（ebioscience公司）;17β-雌二醇（E2,Sigma公司）。

1.2 人胎兒肺臟來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞分離及純化間充質(zhì)細(xì)胞分離及純化參照我們前期的研究方法[16]。即取水囊引產(chǎn)的胎兒,在無(wú)菌狀態(tài)下打開(kāi)胸腔,取肺臟放入平皿中,用 PBS洗 3次,盡量除去血細(xì)胞。在基本培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%FBS）中,將肺臟組織剪成碎塊,加2 g/L的膠原酶VI,37℃振蕩消化15～25分鐘,過(guò)200目篩網(wǎng),獲得細(xì)胞懸浮液。然后用基本培養(yǎng)基洗3次,培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中（10%FBS）。調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L-1培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃恒溫,5%CO2）,2～3天后,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板,全量換液,待細(xì)胞鋪滿度達(dá)80%左右,用2.5 g/L的胰酶消化,常規(guī)傳代。取第4代到第7代的細(xì)胞,分析其表面標(biāo)志,確定其為MSC后用于試驗(yàn)。

1.3 小鼠DC的分離培養(yǎng)與鑒定 DC的分離及純化參照我們前期的研究方法[17],6～8周齡雌性C57BL/6小鼠,拉頸處死,無(wú)菌狀態(tài)取出股骨和脛骨,反復(fù)沖洗骨髓,加入紅細(xì)胞裂解液室溫5分鐘,去除紅細(xì)胞,2×106m l-1細(xì)胞培養(yǎng)于RMPI1640完全培養(yǎng)基（10%FCS,1 ng/m l IL-4和10 ng/m l GMCSF）,隔天半換液,誘導(dǎo)7天后,獲得DC。然后與MSC在RMPI1640完全培養(yǎng)基體系下共培養(yǎng),在LPS刺激后培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 增殖貼壁 MSC鋪板后2小時(shí)加入10μl不同濃度E2（E2溶于無(wú)水乙醇配成10-2mol/L貯存液,PBS稀釋至10-7、10-6和10-5mol/L作為工作液,使用時(shí)加入10μl工作液至1m l培養(yǎng)基中,使終濃度分別為:低 、中 、高:10-9、10-8和 10-7mol/L）,對(duì)照組加入10μl用PBS同樣倍比稀釋的無(wú)水乙醇,24小時(shí)后測(cè)定MSC各項(xiàng)功能或與DC進(jìn)行共培養(yǎng),后續(xù)實(shí)驗(yàn)皆采用同樣處理方式。E2處理MSC 24小時(shí)后,將細(xì)胞消化重懸計(jì)數(shù),再重鋪板,2小時(shí)后計(jì)數(shù)未貼壁細(xì)胞。

1.5 RT-PCR測(cè)定細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 用Trizol試劑提取細(xì)胞中總的RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA,反應(yīng)條件:42℃20分鐘,99℃5分鐘,4℃5分鐘。PCR擴(kuò)增試劑盒采用PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工）,反應(yīng)體系25μl,引物序列 :內(nèi)參對(duì)照β-actin:上游 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′,下游 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′;IL-6:上游 5′-GACTGATGTTGTTGACAGCCACTGC-3′,下游5′-AGCCACTCCTTCTGTGACTCTAACT-3′;TGF-β :上游5′-CAACAATTCCTGGCGATACCTCA-3′,下游5′-ATCCACTTCCAGCCGAGGTCCTT-3′;VEGF:上游5′-AAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATG-3′,下 游5′-GCGAATTCCTCCTGCCCGGCTCA-3′（英駿公司合成）;反應(yīng)條件:94℃2分鐘,94℃45秒,55℃45秒,72℃45秒,72℃6分鐘,30個(gè)循環(huán)。用1.5%的瓊脂糖作凝膠電泳后,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。每次實(shí)驗(yàn)中的同組細(xì)胞重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志 消化收集細(xì)胞,PBS洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞密度約1×109L-1。加入相應(yīng)抗體,4℃避光孵育30分鐘,PBS洗滌兩次后上機(jī)檢測(cè)。MSC 檢測(cè)標(biāo)志為:CD117、CD29、CD31、CD44、CD105及CD45;DC檢測(cè)標(biāo)志為:CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ。

1.7 MSC與DC的共培養(yǎng) E2刺激MSC 24小時(shí)后,去上清,PBS洗滌一次,加入IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)7天的DC（MSC∶DC=1∶10）培養(yǎng)于新鮮RMPI1640完全培養(yǎng)基,加LPS刺激24小時(shí),流式測(cè)定DC表面分子的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 MSC的形態(tài)學(xué)觀察和表面標(biāo)記物檢測(cè) 原代培養(yǎng)早期細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性較大,以梭形多角形為主。消化傳代后從第2代起開(kāi)始穩(wěn)定生長(zhǎng),至第3代可獲得較均一的MSC。細(xì)胞形態(tài)均一,為梭形或成纖維樣、體積較大、單個(gè)核,呈漩渦樣生長(zhǎng)（圖1A和B）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,胎肺MSC穩(wěn)定均一的表達(dá)CD29和CD44（纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體,基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)）、CD105（即SH-2）;不表達(dá)CD117（多能造血干細(xì)胞標(biāo)志）、CD31（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志）和CD45（造血細(xì)胞標(biāo)志）,經(jīng)3代以上傳代后,細(xì)胞成分均一,純度在95%以上（圖1C）。

2.2 E2影響MSC的增殖和貼壁能力,但不影響MSC表面標(biāo)記的表達(dá) 將MSC以10 000孔鋪于24孔板,每組3個(gè)復(fù)孔,加入E2處理24小時(shí)后細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明,低濃度E2作用后MSC的數(shù)量低于對(duì)照組,隨著E2濃度的升高,MSC的增殖能力逐漸增強(qiáng),在10-7mol/L高濃度E2作用下MSC增殖能力高于正常對(duì)照（P＜0.05）（圖2A）。再將細(xì)胞重鋪板,2小時(shí)后計(jì)數(shù)未貼壁細(xì)胞,計(jì)算貼壁率,E2處理后MSC貼壁能力均高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖2B）。E2對(duì)MSC的表型沒(méi)有影響,用三種濃度的E2處理MSC 24小時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC表面標(biāo)記CD117、CD29、CD31、CD44、CD105 及 CD45 的表達(dá) ,結(jié)果顯示,各處理組間（綠、紅和藍(lán)線表示）MSC表面標(biāo)志的表達(dá)沒(méi)有差異,且處理組和對(duì)照組（黃線表示）間也均無(wú)差異（圖2C）。

2.3 E2調(diào)節(jié)MSC對(duì)DC表型的影響 E2能逆轉(zhuǎn)MSC對(duì)DC的抑制作用,將MSC用E2預(yù)處理24小時(shí),然后與用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)7天的DC共培養(yǎng),加LPS（100 ng/ml）刺激DC成熟。24小時(shí)后用流式細(xì)胞儀測(cè)定DC成熟和功能標(biāo)志MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)。結(jié)果表明,與單獨(dú)DC組相比MSC+DC共培養(yǎng)組中DC的CD86的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖3A）,而MHC Ⅱ和CD80的變化無(wú)顯著性差異（圖3C）;當(dāng)E2處理的MSC與DC共培后,DC表面MHCⅡ、CD80和CD86的表達(dá)均比MSC+DC共培養(yǎng)組有所提高（圖3A、B和C）,且在中及高濃度E2處理的MSC組中這種逆轉(zhuǎn)更為顯著（圖3A和C）（P＜0.05）,提示E2能逆轉(zhuǎn)MSC對(duì)DC的抑制作用。

圖1 人胎肺MSC的形態(tài)和表面標(biāo)志Fig.1 Themorphology and surfacemarker of human fetal lung MSC

圖2 E2作用后MSC的增殖貼壁能力以及MSC表面標(biāo)志的表達(dá)Fig.2 The proliferation,adherent ability and surfacemarker of MSC after treated with E2

圖3 E2處理過(guò)的MSC對(duì)DC表面標(biāo)志的表達(dá)的影響Fig.3 The effects of MSC treated with E2 on the surface marker of DC

圖4 E2處理后MSC分泌細(xì)胞因子的變化Fig.4 ValuateMSC's cytokine secretion after treated with E2

2.4 E2能改變MSC分泌細(xì)胞因子的水平 E2處理MSC 24小時(shí)后,提取MSC的mRNA,RT-PCR擴(kuò)增IL-6、TGF-β和 VEGF 片段（圖4A）,從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出E2對(duì)MSC細(xì)胞因子的表達(dá)均有影響,在低濃度E2刺激時(shí) IL-6、TGF-β和VEGF表達(dá)均增加（圖4B、C和D）,但隨著E2濃度增高這三種細(xì)胞因子的表達(dá)均逐漸降低,其中IL-6和VEGF高于對(duì)照組（圖4B、D）,而高濃度 E2處理后,表達(dá)的TGF-β與對(duì)照組相比減少（P＜0.05）（圖4C）,提示E2能影響MSC細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

3 討論

雌激素能影響間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的增殖及功能,我們選用雌二醇（E2）的兩個(gè)正常生理濃度10-9mol/L和10-8mol/L以及妊娠末期雌激素的峰值濃度10-7mol/L,考察在不同濃度E2作用下MSC的增殖、表型和細(xì)胞因子的表達(dá)以及MSC對(duì)DC的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在相當(dāng)于孕期峰值濃度（高濃度:10-7mol/L）的E2作用下,MSC的增殖和貼壁能力比對(duì)照組有所增加,但MSC表面標(biāo)志的表達(dá)并無(wú)明顯差異,這表明高濃度E2存在有利于MSC的增殖和增加細(xì)胞活性,但對(duì)MSC的表型以及純度并沒(méi)有太大影響。

MSC對(duì)DC有免疫抑制作用[5,6],我們思考在E2作用下MSC的功能發(fā)生怎樣的改變,其對(duì)DC的抑制作用有沒(méi)有變化?MSC幾乎不表達(dá)MHCⅡ,具有低免疫原性的特點(diǎn)[18],并且以往的一些實(shí)驗(yàn)證明人源MSC輸注MRL狼瘡小鼠有治療作用且不引起排斥反應(yīng)[11],所以我們選用人胎肺MSC與小鼠DC進(jìn)行共培養(yǎng),在此實(shí)驗(yàn)中,可以看到正常的MSC能抑制DC的成熟,DC的CD86顯著下降,MHCⅡ和CD80基本不變,但用E2預(yù)處理后的MSC和DC共培,發(fā)現(xiàn)E2+MSC+DC組的DC與MSC+DC組相比,DC的CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)均有回升,尤其以CD86和MHCⅡ的回升更為明顯,提示MSC的免疫抑制作用在一定程度上可能被E2逆轉(zhuǎn)了。那么,MSC在E2作用下,是由于什么發(fā)生了改變而導(dǎo)致降低其對(duì)DC的免疫抑制能力?有研究報(bào)道MSC通過(guò)分泌的IL-6和TGF-β等對(duì)DC的分化有著部分抑制作用[19,20],故我們檢測(cè)E2作用下MSC分泌細(xì)胞因子的變化。結(jié)果表明E2刺激時(shí)IL-6、TGF-β和VEGF表達(dá)均增加,但隨著濃度升高三者表達(dá)均逐漸降低,在高濃度E2（10-7mol/L）作用MSC 24小時(shí)后,MSC表達(dá)的TGF-β與對(duì)照組相比減少,而IL-6和VEGF的表達(dá)仍高于對(duì)照組。

TGF-β1是重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子,而且能抑制淋巴細(xì)胞以外的細(xì)胞[21],有實(shí)驗(yàn)報(bào)道MSC能通過(guò)分泌的TGF-β抑制DC的成熟功能,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到,在正常生理濃度范疇的E2刺激時(shí),TGF-β高于正常組,但當(dāng)用妊娠期高濃度E2（10-7mol/L）作用下,MSC分泌的TGF-β減少,這可能是MSC對(duì)DC抑制減弱的原因之一。

迄今為止,關(guān)于IL-6對(duì)DCs分化發(fā)育的影響尚無(wú)定論,Park等[22]發(fā)現(xiàn)在gp130轉(zhuǎn)基因小鼠中,IL-6刺激降低了 LPS介導(dǎo) DCs上的MHCⅡ類(lèi)分子、CD80、CD86和IL-12的表達(dá),減弱了 DCs刺激 T細(xì)胞活化的能力;與之相反的是,Hegde等[23]發(fā)現(xiàn)IL-6可使單核細(xì)胞來(lái)源的DCs上MHCⅡ類(lèi)分子、CD86的表達(dá)顯著提高。所以在我們?cè)囼?yàn)中,三種濃度E2處理后MSC分泌IL-6的均增多可能與DC的MHCⅡ、CD80和CD86的回升有關(guān)。另外,E2能通過(guò)促進(jìn)MSC表達(dá)VEGF促進(jìn)局部缺血后的心肌修復(fù)[15],但也有研究認(rèn)為MSC并不通過(guò)VEGF對(duì)DC發(fā)揮抑制作用[19],本實(shí)驗(yàn)中在中、低濃度E2作用下表達(dá)略有升高,而在高濃度E2時(shí)恢復(fù),這種變化是否對(duì)MSC抑制DC能力產(chǎn)生影響有待研究。

從以上分析我們推測(cè),在不同濃度E2作用下MSC分泌的細(xì)胞因子發(fā)生改變,從而改變了對(duì)DC的抑制能力,尤其是高濃度E2作用后MSC分泌TGF-β和IL-6的改變可能導(dǎo)致MSC對(duì)DC抑制能力的降低,這也許是SLE在妊娠期病情加重的機(jī)理之一,但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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[收稿2009-07-13 修回2009-08-28]

（編輯 張曉舟）

Estrogen can alter the immuno-suppressive effects of MSC on DC via modulating MSC′s cytokine secretion

ZHAOYe-Lin,ZHAOXiao-Yin,SUNLing-Yun,HOUYa-Yi.ImmunologyandReproductiveBiologyLaboratory,Medical SchoolofNanjingUniversity,Nanjing210093,China

Objective:To investigate the effectsof 17β-Estradiol（E2）onmesenchymal stem cells（MSC）and toevaluate the effectsof MSC treated with E2 on thematurationand function of dendritic cells（DC）.Methods:We first isolated and culturedMSC from the human fetal lung.TheMSCwere treatedwith E2 for24 hours at various concentrations（10-9,10-8and 10-7mol/L）.After cell counting,proliferation,adherent ability and immunophenotypes ofMSCwere detected by flowcytometry.Thegeneexpressionsof cytokine（IL-6,TGF-βand VEGF）were measured by RT-PCR.The effects ofMSC treated with E2 on thematuration and function of DCwere determined.Results:After treated with E2,the p roliferation and adherent ability ofMSCwere increased,while the immunophenotypes ofMSCwere not affected.When MSCs co-cu lturedwith DC,MSC could inhibit the immuophenotypes and function of DC.However,when DC co-cultured with E2-pretreated MSC,the immunophenotypes（MHCⅡ,CD80 and CD86）of DC had been reconstructed.After treatedwith the high concentration of E2 for24 hours,MSC secreted lower level of TGF-βthan that in the control group,while IL-6 and VEGF expressionswere increased comparedwith those in the controlgroup.Conclusion:Estrogenmay alter the immuno-suppressive effects ofMSC on DC viamodulating the cytokine secretion ofMSC.

17β-Estradiol（E2）;Mesenchymal stem cells（MSC）;Dendritic cells（DC）;System ic lupus erythematosus（SLE）

R392

A

1000-484X（2010）01-0041-06

①本文受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.30771959）和江蘇省自然科學(xué)基金（No.2006119）資助

②南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,南京210008

趙葉琳（1986年-）,女,在讀碩士,E-mail:zhaoyelin.nju@gmail.com;

及指導(dǎo)教師:侯亞義（1960年-）,男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事分子免疫學(xué)研究,E-mail:yayihou@nju.edu.cn。