流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)趨化因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)①

王革非 李衛(wèi)中 張 衡 曾 俊 張丹桂 陳幼瑩 陳小璇 李康生

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 廣東高校免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,汕頭 515041）

流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)趨化因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)①

王革非 李衛(wèi)中 張 衡 曾 俊 張丹桂 陳幼瑩 陳小璇 李康生

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 廣東高校免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,汕頭 515041）

目的:探討膠質(zhì)細(xì)胞感染流感病毒后的天然免疫反應(yīng),檢測(cè)流感病毒H1N1和H 5N1體外感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,是否會(huì)誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的變化及其規(guī)律。方法:從新生小鼠大腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,并進(jìn)一步純化小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)純度鑒定后,用感染復(fù)數(shù)為2的流感病毒H1N1和H5N1進(jìn)行體外感染,8小時(shí)后用免疫熒光檢測(cè)流感病毒核蛋白（NP）的表達(dá),以確認(rèn)感染細(xì)胞比例。在感染早期（6小時(shí)）和感染中期（24小時(shí)）分別提取細(xì)胞RNA,檢測(cè)趨化因子轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果:分離得到小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,病毒感染后超過95%的細(xì)胞可以被感染,感染后的小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9和CXCL-10的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào),其中CXCL-10的上調(diào)幅度最為明顯,禽流感病毒H5N1感染能誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的上調(diào)反應(yīng)。結(jié)論:流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞,可誘導(dǎo)趨化因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。

小膠質(zhì)細(xì)胞;星形膠質(zhì)細(xì)胞;流感病毒;趨化因子

流感病毒的感染除能造成人呼吸系統(tǒng)疾病外,在部分感染人群中會(huì)出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）病變[1],即流感相關(guān)腦病/腦炎（Influenza associated encephalopathy or encephalitis）,是指在急性流感過程中伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的一種臨床綜合征,起病快速、病情兇險(xiǎn),主要的臨床表現(xiàn)為癲癇發(fā)作、意識(shí)消退、昏迷等,嚴(yán)重時(shí)引起神經(jīng)后遺癥或死亡,如雷耶氏綜合征（Reye's syndrome）、出血性休克與腦病綜合征（Hemorrhagic shock and encephalopathy syndrome）和急性壞死性腦病（A-cute necrotizing encephalopathy）等[2-4]。在流感患者,尤其是兒童中,具有一定的發(fā)病率和死亡率[4]。流感病毒可通過被破壞的血腦屏障、嗅球-三叉神經(jīng)節(jié)、內(nèi)臟-神經(jīng)途徑及其它可能途徑感染CNS[4],在流感相關(guān)腦病患者的腦脊液和腦組織中可以檢測(cè)到流感病毒RNA及相關(guān)抗原的存在[5,6]。但流感相關(guān)腦病的發(fā)病機(jī)制仍不明確。

在流感相關(guān)腦病病人的腦脊液中,發(fā)現(xiàn)促炎癥細(xì)胞因子的濃度升高[6-8]。在CNS中,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是細(xì)胞因子分泌的主要來源[9]。在流感病毒感染中,促炎癥細(xì)胞因子釋放的強(qiáng)度被認(rèn)為與疾病的嚴(yán)重程度存在可能的正相關(guān)聯(lián)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子及趨化因子在免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的連接和調(diào)節(jié)中起到十分重要的作用,促炎癥因子的過量釋放不僅造成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的免疫損傷和凋亡,還會(huì)影響外周免疫并誘導(dǎo)全身性反應(yīng)[10,11]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受流感病毒感染后,膠質(zhì)細(xì)胞過度釋放的促炎癥細(xì)胞因子,可能會(huì)誘導(dǎo)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂及全身性癥狀。

因此,研究流感病毒是否會(huì)誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生促炎癥細(xì)胞因子反應(yīng),明確促炎癥因子與趨化因子的類型,將有助于理解膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染CNS時(shí)的功能和作用。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo) IL-1β、TNF-α和 IL-6的過度釋放[12],流感病毒H5N1在肺部誘發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴中,除上述3種促炎癥因子外,IP-10、CCL-5等趨化因子的表達(dá)亦發(fā)生過度釋放[13-15],因此,本研究利用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染膠質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)是否出現(xiàn)趨化因子表達(dá)的上調(diào),明確小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后,所發(fā)生的促炎癥因子反應(yīng)中趨化因子類型與變化,為闡明流感相關(guān)腦病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1至2日齡無特異病原（Specific pathogen free,SPF）的BALB/c小鼠由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 流感病毒毒株 人A型流感病毒A/Shantou/169/06（H1N 1）分離于2006年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科門診上呼吸道感染兒童[16]。禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/1/05（H5N1）分離于2005年廣東省。流感病毒在MDCK細(xì)胞和9～10日齡的雞胚進(jìn)行初步增殖收獲病毒母液,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)血清/血凝抑制實(shí)驗(yàn)鑒定病毒亞型,病毒為本室保存。利用10%醛化的豚鼠紅細(xì)胞及雞紅細(xì)胞懸液,使用紅細(xì)胞吸附/洗脫以及超濾的方法對(duì)A型流感病毒A/Shantou/169/06（H1N1）和A/Chicken/Guangdong/1/05（H 5N1）進(jìn)行純化[1-3]。經(jīng)超濾離心管（M illipore）更換病毒緩沖體系后,-80℃保存,測(cè)定病毒滴度。

1.3 新生小鼠大腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 將1至2天新生小鼠大腦皮層組織取出,于DMEM/F12（1∶1,v/v）培養(yǎng)基中吹打分散后,用50μm濾器過濾得到細(xì)胞懸液。37℃放置30分鐘去除成纖維細(xì)胞。未貼壁細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后第2天和第4天,棄去未貼壁的細(xì)胞,更換培養(yǎng)基。以后每5～7天更換一次培養(yǎng)基,至膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)成單層。

1.4 小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離 長(zhǎng)成單層的膠質(zhì)細(xì)胞0.05%胰酶37℃作用約10分鐘,將含有星形膠質(zhì)細(xì)胞的胰酶液經(jīng)終止、離心后培養(yǎng)。1天將細(xì)胞培養(yǎng)瓶固定于定軌搖床（上海智誠(chéng)）中 37℃、200 r/min、振幅30 mm水平震蕩60分鐘,棄懸浮細(xì)胞,加入10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1天后,按上述方法再次進(jìn)行震蕩分離,得到純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

長(zhǎng)成單層的混合膠質(zhì)細(xì)胞用0.1%胰酶37℃作用約15分鐘,鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞脫落后,棄去消化液,DMEM/F12清洗 2遍,加入胰酶消化液（0.25%trysin/0.02%EDTA）37℃作用5～10分鐘,得到小膠質(zhì)細(xì)胞組分[6],經(jīng)終止、離心后用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

分離后的小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞,使用CD11b和膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗體進(jìn)行免疫熒光法檢測(cè)純度。星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞按每孔105個(gè)細(xì)胞接種12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 流感病毒感染神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,用0.5ml含有2×105pfu流感病毒（H1N1和H5N1）的病毒液感染,感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection,MOI）為2,37℃吸附1小時(shí)。吸附結(jié)束后,每孔加入1m l無血清DMEM/F12,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)立未感染孔為陰性對(duì)照。感染/刺激后6小時(shí)和24小時(shí)收集細(xì)胞,經(jīng)PBS清洗后,用于RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及半定量PCR。

1.6 流感病毒核蛋白的免疫熒光檢測(cè) 為檢測(cè)流感病毒是否感染在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,將感染8小時(shí)的膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)固定與穿孔后,利用抗甲型流感病毒NP單克隆抗體（Vector Lab）為一抗,Cy3標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（碧云天生物技術(shù)研究所）為二抗,對(duì)流感病毒核蛋白NP免疫熒光檢測(cè)。

1.7 膠質(zhì)細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 感染后的膠質(zhì)細(xì)胞,使用RNeasy Minikit（Qiagen）試劑盒提取細(xì)胞的RNA,實(shí)驗(yàn)方法參照Qiagen公司說明書。取1μg的 RNA,用SuperScript Ⅲ RNaseH-Reverse Transcriptase（Invitrogen）和隨機(jī)六堿基引物（hexaprimers,大連寶生物工程公司）反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為20μl。25℃反應(yīng)5分鐘、50℃繼續(xù)反應(yīng)60分鐘完成反轉(zhuǎn)錄,70℃15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶,得到反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于半定量PCR反應(yīng)。

1.8 小鼠膠質(zhì)細(xì)胞感染流感病毒后炎癥相關(guān)因子的半定量PCR檢測(cè) cDNA用特異性引物進(jìn)行半定量PCR,用于檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后,趨化分子（CCL-2、CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10）的表達(dá)變化情況。引物見表1,退火溫度根據(jù)引物堿基長(zhǎng)度組成及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為56℃～60℃,反應(yīng)循環(huán)次數(shù)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為32～40循環(huán)。PCR使用預(yù)混的PCR反應(yīng)液（MasterM ix,北京天根）,反應(yīng)體系25μl,其中,Premix Taq Mixture 12.5 μl、引物 12 μl（0.5 μmol/L）、cDNA 0.5 μl,按照產(chǎn)品說明書和引物參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、拍照后,用BandScan4.3分析條帶的灰度值。各個(gè)基因的PCR產(chǎn)物灰度值同樣品內(nèi)參GAPDH基因PCR產(chǎn)物灰度值進(jìn)行均一化,以未感染對(duì)照樣品相應(yīng)基因PCR產(chǎn)物均一化后的比值為100%,計(jì)算感染樣品基因轉(zhuǎn)錄變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 圖1所示,小鼠原代培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)約20～25天,細(xì)胞長(zhǎng)成單層,即可用于分離小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。利用不同濃度胰酶的分步消化可得到純化的小膠質(zhì)細(xì)胞,通過低濃度胰酶分離和搖床震蕩培養(yǎng)可得到純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞選用細(xì)胞特異性表面標(biāo)志CD11b進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),星形膠質(zhì)細(xì)胞用GFAP為細(xì)胞特異性標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè),細(xì)胞均出現(xiàn)特異性的熒光染色,相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞或一抗缺失樣品則沒有熒光出現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度均超過95%。

表1 趨化因子PCR引物列表Tab.1 The detail information of the primers of chemokines

圖1 混合膠質(zhì)、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)（40×）Fig.1 Isolation and culture ofm ixed glial cells,m icroglia,and astrocytes（40×）

圖2 膠質(zhì)細(xì)胞感染流感病毒 H1N1和H5N1 8小時(shí)后的NP蛋白染色（200×）Fig.2 NP immunofluorescence staining of H1N1 and H5N1 infected microglia and astrocy tes at 8 h p.i.（200×）

2.2 流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞的NP蛋白檢測(cè) 小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)流感病毒H 1N1和H5N1吸附后繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí),對(duì)甲型流感病毒的NP蛋白進(jìn)行免疫熒光染色,如圖2所示,在H1N1和H5N1吸附培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中,均出現(xiàn)陽性的熒光信號(hào),表明流感病毒在吸附細(xì)胞后,能夠進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的生物合成和復(fù)制,表達(dá)流感病毒復(fù)制所需的NP蛋白。當(dāng)流感病毒H1N1和H5N1在MOI為2時(shí),首輪培養(yǎng)即可以導(dǎo)致超過95%以上的細(xì)胞感染流感病毒。

2.3 流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)趨化因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào) 使用半定量PCR檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后,趨化因子CCL-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10的表達(dá)變化情況。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,對(duì)引物進(jìn)行了優(yōu)化,選取了擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)的引物用于該實(shí)驗(yàn),確定了相應(yīng)的引物最適退火溫度,同時(shí)選擇PCR產(chǎn)物的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)階段后期的循環(huán)數(shù)為最適循環(huán)次數(shù),對(duì)上述基因的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。

對(duì)PCR產(chǎn)物電泳照片進(jìn)行灰度分析,各樣本以32個(gè)循環(huán)的內(nèi)參基因GAPDH的灰度值進(jìn)行均一化處理,然后各基因以對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)量為參照（100%）進(jìn)行比值處理,基因的表達(dá)變化結(jié)果見圖4。結(jié)果表明,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后6小時(shí)和24小時(shí),趨化因子的表達(dá)發(fā)生不同程度的上調(diào)。圖3和圖4的結(jié)果提示,流感病毒不同亞型在同等感染條件下,H5N1比H1N1能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞更強(qiáng)烈的炎癥因子反應(yīng),趨化因子的表達(dá)上調(diào)幅度更大。

圖3 膠質(zhì)細(xì)胞感染流感病毒H1N1和H5N1后趨化因子電泳圖Fig.3 The PCR products electrophoresis photo of chemokines of in fluenza H 1N1 and H5N1 infected glial cells

圖4 膠質(zhì)細(xì)胞感染流感病毒H1N1和H5N1后趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.4 The transcrip t levels of chemokines of influenza H1N1 and H5N1 in fected glial cells

3 討論

盡管流感病毒能夠感染中樞神經(jīng)系統(tǒng),流感病毒相關(guān)的腦病與腦炎綜合征的發(fā)病機(jī)制仍然不明確。流感病毒相關(guān)腦病與腦炎綜合征患者的腦脊液和血漿中,促炎癥細(xì)胞因子水平異常升高[6-8]。異常升高的促炎癥細(xì)胞因子常常引發(fā)局部或系統(tǒng)性的免疫病理損傷[10,11]?？梢酝茰y(cè)在流感病毒相關(guān)腦病與腦炎綜合征的發(fā)生和發(fā)展中,不僅存在著病毒的直接破壞作用,同時(shí)可能伴隨著炎癥細(xì)胞因子大量釋放而造成的免疫病理損傷。

流感病毒,尤其是H 5N1毒株,在體外可誘導(dǎo)多種細(xì)胞釋放高濃度的促炎癥細(xì)胞因子,在體內(nèi)的局部器官和血漿中也發(fā)現(xiàn)存在著大量促炎癥細(xì)胞因子的積累,大量釋放和積累的促炎癥因子,如TNF-α、IL-1β等,通過細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（Cytokine cascade）,產(chǎn)生以細(xì)胞因子分泌失調(diào)和過度釋放為表現(xiàn)的細(xì)胞因子風(fēng)暴效應(yīng)（Cytokine storm）,從而可能引發(fā)相應(yīng)的免疫病理損傷,這種以促炎癥細(xì)胞因子過度釋放導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是高致病性H5N1引起嚴(yán)重疾病的可能原因[13-15]。

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答過程起關(guān)鍵作用,同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子的主要分泌來源[9]。因此,探索小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后所發(fā)生的變化及免疫反應(yīng),對(duì)理解流感病毒相關(guān)的腦病與腦炎綜合征的發(fā)病機(jī)制有一定的幫助。本研究以小鼠大腦的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞為靶細(xì)胞,用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞趨化因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

對(duì)人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1吸附后8小時(shí)的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行A型流感病毒NP蛋白免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)存在大量表達(dá)的NP蛋白,表明H1N1和H 5N1病毒可以感染星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,并在細(xì)胞中進(jìn)行了病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果究表明,流感病毒感染后趨化因子 CCL-3、CCL-5、CXCL-2 、CXCL-3、CXCL-10 等的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。其中,禽流感病毒H5N1感染的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,其促炎癥細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)上調(diào)水平高于H 1N1感染的細(xì)胞。

流感病毒感染所誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子反應(yīng)中,除了促炎癥因子上調(diào)外[12],本研究亦發(fā)現(xiàn)趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)。促炎癥因子和趨化因子的上調(diào),能夠?qū)е缕渌装Y細(xì)胞趨化因子、粘附分子、急性時(shí)相蛋白和組織蛋白酶等的合成,當(dāng)其表達(dá)上調(diào)過于強(qiáng)烈時(shí),則引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。趨化因子可以募集并活化巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞（如 CCL-3/MIP1α,CXCL-2/MIP2,CXCL-9/M IG 等）、激活細(xì)胞抗病毒免疫（如CCL-5/RANTES,CXCL-10/IP10等）,從而抵御病毒攻擊,但趨化因子表達(dá)的異常上升會(huì)使免疫細(xì)胞過度集中及活化而導(dǎo)致免疫病理損傷。膠質(zhì)細(xì)胞感染H5N1病毒后,促炎癥細(xì)胞因子以及趨化因子的水平發(fā)生了強(qiáng)烈的上調(diào)。在流感病毒感染中,促炎癥細(xì)胞因子釋放的強(qiáng)度被認(rèn)為與疾病的嚴(yán)重程度存在可能的正相關(guān)聯(lián)[15]。細(xì)胞因子及趨化因子在免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的連接和調(diào)節(jié)中起到十分重要的作用[10,11]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,促炎癥因子的過量釋放不僅造成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的免疫病理損傷和凋亡,還會(huì)影響外周免疫并誘導(dǎo)系統(tǒng)性反應(yīng)[6,20]。因此,中樞神經(jīng)系統(tǒng)受H5N1感染可以誘導(dǎo)比人流感病毒感染更嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂及系統(tǒng)性疾病。

促炎癥細(xì)胞因子與趨化因子的過度釋放,可能參與了對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的直接破壞作用和對(duì)腦部組織的間接免疫病理損傷作用,這些可能是誘導(dǎo)及加重流感相關(guān)腦病和腦炎的重要因素。另一方面,應(yīng)用具有多向性生物活性的免疫抑制因子IL-10以及其它促炎癥因子抑制劑,如IL-1受體拮抗肽（IL-1 receptor antagonist,IL-1ra）、TNF拮抗肽等,來平衡或抑制嚴(yán)重的促炎癥反應(yīng),為緩解或減輕細(xì)胞因子風(fēng)暴可能造成的繼發(fā)性免疫病理損傷提供思路。

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[收稿2009-05-26 修回2009-08-19]

（編輯 張曉舟）

Upregulation of chemokine transcriptive levels induced by avian H 5N1 and human H1N1 in fluenza viruses inmousem icroglia and astrocytes

WANGGe-Fei,LIWei-Zhong,ZHANGHeng,ZENGJun,ZHANGDan-Gui,CHENYou-Ying,CHENXiao-Xuan,LI Kang-Sheng.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,theKeyImmunopathologyLaboratoryofGuangdongProvince,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China

Objective:To investigate the innate immune response of influenza virus-infected glial cells,the transcription levels in chemokines inmousemicroglia and astrocyteswere detected which pre-infected by human H1N1 or avian H5N1 influenza viruses.Methods:The glial cells isolated from neonatalm ice cerebral cortex were cultured and furthermicrogliaand astrocyteswere purified.The primarymouse microglia and astrocyteswere infected in vitroby H1N1or H5N1 influenza virusesinamultip licity of infection（MOI）2.Eighthours post infection,the influenza virus nucleoprotein（NP）was detected by immunofluorescence to identify the proportion of infected cells.The cellular RNA were extracted at 6 h and 24 h to detect the transcriptional levelof chemokines by semi-quantitative RT-PCR.Results:More than 95%of the microglia and astrocyteswhich isolated from micewere infected.The transcription levels of CCL-3,CCL-5,CXCL-2,CXCL-9and CXCL-10 from infectedm icroglia and astrocyteswere upregulated.Futhermore,themRNA levelof CXCL-10 increasedmuchmore.In addition,avian H5N1 influenza virus could inducemore strongerup regu lation of those chemokines than human H1N1 did.Conclusion:Themousemicroglia and astrocyteswhich are infected by H1N1 influenza virus orH5N1 influenza virus could induce upregulation of transcription levelof chemokines.

Microglia;Astrocyte;Influenza virus;Chemokine

R392.6 R373.1

A

1000-484X（2010）01-0029-06

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30771988,30972766）、廣東省自然科學(xué)基金（9451503102003499,8151503102000022）和廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培育項(xiàng)目（LYM08056）資助

王革非（1978年-）,男,博士,講師,主要從事神經(jīng)免疫與抗感染免疫研究,E-mail:gfwangcn@gmail.com;

及指導(dǎo)教師:李康生（1953年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)免疫與抗感染免疫研究,E-mail:ksli@stu.edu.cn。