卵巢癌患者一線化療后CD8+T細胞和NK細胞數(shù)量及功能動態(tài)變化的研究①

馮勤梅 狄 文 吳 霞

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科上海市教委重點學(xué)科上海婦科腫瘤重點實驗室,上海 200127）

卵巢癌患者一線化療后CD8+T細胞和NK細胞數(shù)量及功能動態(tài)變化的研究①

馮勤梅 狄 文 吳 霞②

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科上海市教委重點學(xué)科上海婦科腫瘤重點實驗室,上海 200127）

目的:研究晚期卵巢癌患者經(jīng)一線化療后體內(nèi)CD8+T細胞和NK細胞數(shù)量及功能的動態(tài)變化。方法:選取術(shù)后行紫杉醇聯(lián)合卡鉑化療的晚期卵巢上皮癌患者共13例,采集化療前（S0）、化療后5～7天（S1）、化療后12～14天（S2）和化療后25～28天（S3）外周血,流式細胞術(shù)檢測患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+和NK細胞的百分比及絕對數(shù)量。采用體外自體腫瘤細胞裂解物脈沖淋巴細胞共培養(yǎng)的方法檢測不同時間點CD8+T細胞IFN-γ的分泌功能,并以LDH釋放法測定NK細胞對K562細胞的殺傷活性。結(jié)果:在一個完整的化療周期中,CD3+、CD4+、CD8+細胞的絕對數(shù)目均于S1期降至最低點,且與 S0期分別都有顯著性差異。與對照組相比,當體外給予自身腫瘤細胞裂解物刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)后,在S1、S2和S3期產(chǎn)生IFN-γ的CD8+細胞比例均較對照組顯著增加,且CD8+IFN-γ+細胞比例在S2期達到最高。NK細胞的絕對數(shù)目于S1期降至最低點,且與S0期有顯著性差異,NK細胞的比例及殺傷活性在化療前、后均無顯著性差異。結(jié)論:卵巢癌患者于一線化療后機體經(jīng)歷免疫重建的過程,該過程中CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答一過性增高,而NK細胞的殺傷活性無明顯變化?；熀竺庖咧亟ㄆ诳赡苁敲庖咧委煂嵤┑淖罴汛翱谄?。

卵巢癌;化療;CD8+T細胞;NK細胞

有關(guān)腫瘤免疫治療的動物研究結(jié)果給人們帶來了巨大的希望,但其臨床效果卻不盡如人意。導(dǎo)致免疫治療療效不佳的重要原因是晚期腫瘤患者體內(nèi)巨大的腫瘤負荷使免疫功能處于嚴重抑制狀態(tài),如抗原遞呈細胞（APCs）功能顯著低下、效應(yīng)T細胞減少而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞增加、協(xié)同刺激及協(xié)同抑制分子表達異常[1]。Rosenberg等回顧分析440例應(yīng)用腫瘤疫苗治療惡性腫瘤的臨床試驗,發(fā)現(xiàn)總體客觀臨床有效率只有2.6%。因此有必要應(yīng)用其他方法來打破免疫耐受,以促進免疫治療的效果[2]。

化療能有效減少腫瘤負荷,但也有致淋巴細胞減少的副作用,因此傳統(tǒng)觀念認為化療會抑制免疫系統(tǒng),并干擾隨后的免疫治療。然而最近的一些研究表明系統(tǒng)化療雖然可以導(dǎo)致淋巴細胞數(shù)量減少,但機體也可能啟動免疫自穩(wěn)機制使體內(nèi)殘余的淋巴細胞發(fā)生活躍增生[3];此外化療藥物誘導(dǎo)體內(nèi)大量腫瘤細胞凋亡,促使腫瘤抗原的交叉遞呈率顯著增強[4,5]。迄今一些荷瘤動物模型和零星的Ⅱ、Ⅲ期臨床實驗也證實化療不僅不會削弱免疫治療的療效,且與免疫治療存在協(xié)同作用[6]。

鑒于上述研究背景,本研究檢測了晚期卵巢癌患者經(jīng)一線化療后體內(nèi)T細胞亞群、NK細胞數(shù)量及其在淋巴細胞中所占比例的動態(tài)變化,并進一步檢測了CD8+T細胞和NK細胞功能的動態(tài)變化,從而探索化療后獲得性和天然免疫應(yīng)答的變化,以期明確化療后機體是否存在免疫抑制暫時逆轉(zhuǎn)之“窗口期”。本研究將為卵巢癌化療聯(lián)合免疫治療的合理應(yīng)用提供不可缺少的信息。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和樣本采集 病例選自2007年6月至2008年8月間在仁濟醫(yī)院住院手術(shù)及化療的原發(fā)性卵巢上皮癌患者（Ⅲ、Ⅳ期）共13例,年齡范圍46～63歲,平均年齡54.6歲。全部患者均無免疫系統(tǒng)疾患,經(jīng)篩選除外高血壓、糖尿病、肝腎疾病患者。所有患者均行經(jīng)腹全子宮+雙附件+大網(wǎng)膜+闌尾切除+腫瘤減滅術(shù),術(shù)后1月給予紫杉醇+卡鉑化療,具體方案為紫杉醇175mg/m2（輸注＞3小時）、卡鉑AUC 5.0,靜注?；熎陂g無急性感染發(fā)生。所有實驗對象于術(shù)中無菌切除腫瘤組織、化療前后無菌抽取空腹靜脈血標本作血常規(guī)檢測,部分血經(jīng)肝素抗凝后作它用。以年齡為匹配條件,同期選擇13名健康女性作為對照組。

1.2 實驗材料 淋巴細胞分離液（密度1.077,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司,上海）;小鼠抗人CD3（PerCP標記）、CD4（PE標記）、CD8（FITC標記）、CD16/CD56（PE 標記）、CD69（FITC 標記）、IFN-γ（APC標記）、IgG1（APC標記）單克隆抗體（購自BD公司）;PMA（佛波酯）、Ionomycin（離子霉素）（購自Gibco公司）;Cytofix/CytoPerm 試 劑 盒、GolgistoP （BD Pharminge,CA,USA）;RPM I1640培養(yǎng)液、胎牛血清（購自Gibco公司）;紅細胞裂解液（購自北京元和生物公司）。

1.3 外周血T細胞亞群、NK細胞檢測 抗凝管無菌采集每位卵巢癌患者即刻化療前（S0）、化療后5～7天（S1）、化療后12～14天（S2）和化療后25～28天（S3）外周血5 ml（體積）,根據(jù)檢測的目的分別加入各種抗體,4℃避光孵育30分鐘,加入紅細胞裂解液避光10分鐘,離心棄上清,PBS洗滌細胞2次,加入4%多聚甲醛200μl固定后,流式細胞儀檢測。CD3為T細胞表面標志;CD4和CD8為T細胞亞群標志;CD3-CD16+CD56+為NK細胞表面標志。

1.4 腫瘤細胞裂解液制備 無菌取手術(shù)切除的腫瘤組織,剔除結(jié)締組織和壞死組織,用含青霉素（100 U/m l）、鏈霉素（100U/ml）、不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液充分沖洗,剪成肉泥狀。加入0.25%的胰蛋白酶4℃消化過夜。血清終止消化,用200目鋼篩過濾,用玻璃注射器針芯輕輕研磨鋼篩上未濾過的組織塊,同時加入1640培養(yǎng)液,收集濾過液充分吹打成單細胞懸液,洗滌2次,用1640培養(yǎng)液重懸細胞。于10m l離心管中緩慢依次加入100%Ficoll、75%（體積分數(shù)）Ficoll及單細胞懸液各3ml,3 000 r/m in離心30分鐘,吸出上層細胞,PBS洗滌細胞,計數(shù),調(diào)整細胞1×107ml-1。置人液氮內(nèi)10分鐘,取出后速投入37℃水浴溶解,反復(fù)5次。3 000 r/min,離心10分鐘,收集上清,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CD8+T細胞IFN-γ產(chǎn)生功能檢測 采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,并用10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整上述淋巴細胞濃度為1×106m l-1,分為 2組:空白組,加 IL-2 10 ng/ml;實驗組:按1∶10自體腫瘤細胞裂解液加入淋巴細胞中,同時加入IL-2 10 ng/ml,每3天半量換液,7天后收集細胞,分別加人刺激劑PMA、Ionomycin,同時加人Golgistop阻斷胞內(nèi)因子向胞外轉(zhuǎn)運,5%CO2、37℃孵育 5小時,CD3、CD8抗體進行表面標記;加入Cytofix/Cytoperm破壞細胞膜完整性,之后加入胞內(nèi)抗體IFN-γ,對照管加入IgG1。四色流式細胞儀檢測,每管獲取CD3+T細胞10 000個。以T細胞CD69表達率＞95%為質(zhì)控標準。

1.6 NK細胞殺傷活性檢測 采用密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞,5%BSA RPMI1640重懸上述細胞為效應(yīng)細胞,調(diào)整濃度為4×106m l-1。對數(shù)生長期K562細胞為靶細胞,5%BSA RPMI1640調(diào)整細胞濃度為1×105m l-1,以效靶比為40∶1各100μl加入96孔圓底板混合培養(yǎng)。設(shè)置自然釋放孔（100μl靶細胞+100μl5%BSA RPMI1640培養(yǎng)基）,最大釋放孔（100 μl靶細胞+0.8%Triton X-100 100μl）,均設(shè)3復(fù)孔。將培養(yǎng)板移至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱4小時后取出,800 r/min離心3分鐘。每孔吸上清50μl轉(zhuǎn)移至96孔平底板,加入50μl LDH底物反應(yīng)液,常溫避光孵育30分鐘,加入50μl終止液終止反應(yīng),酶標儀測492 nm處OD值。NK細胞活性計算公式如

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示?；颊卟煌瑫r間點均數(shù)的比較采用配對t檢驗,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)檢測 CD3+、CD4+、CD8+、IFN-γ+CD8+和NK細胞比例 圖1為代表性的流式細胞原始圖。

2.2 T淋巴細胞群的變化 患者化療前后外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞均呈先下降后恢復(fù)的趨勢。CD3+細胞的絕對數(shù)量在S1、S2期明顯降低,較S0期有顯著性差異（P＜0.05）;至S3期,其數(shù)量較S0期顯著增多（P＜0.05）;CD3+細胞在淋巴細胞中所占比例則S1、S2、S3期與S0期均無顯著差異。CD4+細胞的絕對數(shù)量在S1、S2期明顯降低,較S0期有顯著性差異（P＜0.05）;其在淋巴細胞中所占比例則S1、S2、S3期與S0期均無顯著差異（圖 2）。CD8+細胞絕對數(shù)量、其在淋巴細胞中所占比例均在S1期明顯降低,較S0期有顯著性差異（P＜0.05）;兩者在S2、S3期均與S0期無差異（圖2）。

2.3 晚期卵巢癌患者化療后CD8+T細胞免疫應(yīng)答功能的動態(tài)變化 采集化療前、化療后3個時間點的外周血淋巴細胞進行培養(yǎng),對照組中淋巴細胞培養(yǎng)液中僅加入IL-2,而在實驗組中則加入IL-2和自體腫瘤細胞裂解液。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩組化療后產(chǎn)生IFN-γ的CD8+細胞比例于S2期顯著增加（P＜0.05）,至S3期又明顯下降,與S0期無明顯差異;進一步的分析發(fā)現(xiàn)無論是 S1、S2、S3期實驗組 IFN-γ+CD8+細胞比例較對照組均顯著增加（P＜0.05）,這表明自體腫瘤抗原可能促進了CD8+細胞的殺傷功能,且在S2期抗原刺激后CD8+細胞反應(yīng)效應(yīng)最高（圖3）。

圖1 代表性的流式細胞原始圖Fig.1 Representative results of flow cytometry analysis

圖2 卵巢癌患者化療后淋巴細胞亞群絕對數(shù)量和比例的動態(tài)變化Fig.2 The dynam ic changes of the number and percentage of lymphocyte subsets in ovarian cancer patients after chemotherapy

圖3 卵巢癌患者化療前、后CD8+T細胞免疫應(yīng)答功能的動態(tài)變化Fig.3 The dynam ic changes of CD8+T cell responses in ovarian cancer patients undergoing chemotherapy

2.4 NK細胞絕對數(shù)及百分比例的動態(tài)變化 NK細胞的絕對數(shù)量在S1期降至最低,且S1、S2期均較S0期顯著降低（P＜0.05）,至S3期其絕對數(shù)量與S1期無明顯差異。NK細胞在淋巴細胞中所占的比例在化療前、化療后各個時間點均無顯著性差異（圖4）。

2.5 NK細胞殺傷活性的動態(tài)變化 LDH釋放實驗的結(jié)果顯示:NK細胞對K562細胞的殺傷活性在S1期較S0期略有下降,至S2期則較S0期略有上升,但其殺傷活性在S1、S2、S3期與S0期相比均無顯著性差異（圖5）。

圖4 卵巢癌患者化療后NK細胞絕對數(shù)量的動態(tài)變化Fig.4 The dynam ic changes of the number and percentage of NK cells in ovarian cancer patients after chemotherapy

圖5 卵巢癌患者化療后NK細胞殺傷活性的動態(tài)變化Fig.5 The dynam ic changes of NK cell function in ovarian cancer patients after chemotherapy

3 討論

患者體內(nèi)針對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答可分為獲得性免疫應(yīng)答和天然免疫應(yīng)答。在獲得性免疫應(yīng)答中,CD8+T細胞起著核心作用。通過過繼轉(zhuǎn)輸抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）可有效消除已建立的腫瘤[7,8]。NK細胞是腫瘤天然免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵成份,它不需預(yù)先致敏即能殺傷腫瘤細胞,其殺傷作用無腫瘤特異性和MHC限制性,構(gòu)成機體抗腫瘤的第一道防線。鑒于CD8+T細胞和NK細胞在腫瘤免疫中的重要作用,本研究以此為切入點,探索化療后卵巢癌患者獲得性和固有免疫應(yīng)答的動態(tài)變化。

紫杉醇和卡鉑是目前國內(nèi)外公認的卵巢癌一線化療藥物,本課題選取手術(shù)后應(yīng)用紫杉醇+卡鉑化療的晚期卵巢癌患者為研究對象,全面檢測了化療前、化療后早期、中期和晚期外周血T細胞亞群的動態(tài)改變。CD3+細胞、CD4+細胞和CD8+細胞的絕對數(shù)量均在S1期降至最低點,隨后開始恢復(fù),但不同細胞其恢復(fù)的動態(tài)過程不盡相同。CD3+細胞數(shù)量在S1期后逐步增多,雖然在S2期仍然顯著降低,但至S3期已完全恢復(fù),甚至較化療前有顯著增加。CD4+細胞數(shù)量在S1、S2期顯著降低,至S3期恢復(fù)到化療前水平。CD8+細胞數(shù)量在S1期降至最低,但隨后迅速恢復(fù),至S2期已經(jīng)恢復(fù)到化療前水平,提示CD8+細胞在化療早期后增生明顯。CD3+和CD4+細胞的比例在化療前后無明顯改變,而CD8+細胞的比例在S1期顯著下降,S2期則恢復(fù)到化療前水平,這提示CD8+細胞在S1期受到明顯抑制,但隨后又迅速大量增生,從而無論是數(shù)量還是所占比例均在S2期得到恢復(fù)。近年的研究發(fā)現(xiàn)各種非遺傳因素（如化療藥物）導(dǎo)致的淋巴細胞減少可誘發(fā)機體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)性增生（免疫重建）,從而使體內(nèi)的T細胞數(shù)目保持在一定的水平。淋巴細胞自穩(wěn)性增生可使腫瘤抗原特異性T淋巴細胞克隆在“廣闊”的空間內(nèi)擴增,增強抗腫瘤的免疫應(yīng)答[3]。我們的研究提示CD8+細胞自S1期后開始發(fā)生明顯的自穩(wěn)性增生,至S2期已恢復(fù)到化療前水平,而CD4+細胞的自穩(wěn)性增殖可能相對后延,至S3期才得以恢復(fù)。

為了進一步探討化療后不同時間點CD8+T細胞的應(yīng)答能力,我們進行了體外功能測定。無論是對照組（無自身腫瘤抗原）還是實驗組（自身腫瘤抗原脈沖淋巴細胞）,化療后分泌IFN-γ的CD8+細胞比例于S2期顯著增加,至S3期又明顯下降。該結(jié)果表明化療后經(jīng)自穩(wěn)性增殖的CD8+細胞的應(yīng)答能力在S2期顯著增強。Coleman等人[9]的研究也發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者體內(nèi)CD8+T細胞的功能不是永遠處于被抑制狀態(tài),成功的化療可提高抗原特異性T細胞免疫應(yīng)答。我們推測化療后CD8+細胞應(yīng)答能力增強的原因至少有以下三點:（1）我們的系列研究中還發(fā)現(xiàn):化療后免疫重建過程中,Tc1/Tc2亞群動態(tài)漂移,其比值在S2期顯著升高,有利于對抗原發(fā)揮應(yīng)答反應(yīng)（文章待發(fā)表）;（2）化療后Treg細胞的絕對數(shù)在S1期降至最低,其百分比例在S2期顯著降低（文章待發(fā)表）。Treg細胞在腫瘤免疫逃逸中起著至關(guān)重要的作用,Treg細胞顯著減少有利于逆轉(zhuǎn)其對CD8+細胞的抑制作用[10];（3）化療后凋亡的腫瘤細胞具有免疫原性,其在體內(nèi)可能起到留置疫苗的作用,促進腫瘤抗原的交叉遞呈并激活CD8+細胞[4]。進一步分析發(fā)現(xiàn)無論是S1、S2、S3期實驗組 IFN-γ+CD8+細胞比例較對照組均顯著增加,這表明當再次給予自身腫瘤抗原刺激時,CD8+細胞能產(chǎn)生更加有效的免疫應(yīng)答。上述研究提示化療后機體存在免疫功能暫時逆轉(zhuǎn)的“窗口期”,于該窗口期實施免疫治療有望發(fā)揮最佳療效。

迄今有關(guān)化療對NK細胞數(shù)量和功能影響的研究寥寥無幾。Bang等人[11]發(fā)現(xiàn),當胰腺癌患者實施吉西他濱與順鉑聯(lián)合化療時,NK細胞的數(shù)量和百分比例在化療后15天降至最低;較之正常人群,胰腺癌患者體內(nèi)的NK細胞殺傷功能顯著降低,化療后15、28天其殺傷功能較化療前上升。Tsavaris等人[12]的研究顯示紫杉烷類化療藥物可顯著增強乳腺癌患者體內(nèi)NK細胞的殺傷功能。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)NK細胞的絕對數(shù)量在S1、S2期均較S0期顯著降低,其在淋巴細胞中所占的比例在化療前、化療后各個時間點均無顯著性差異,這提示化療后NK細胞于S1期開始增生,至化療后25～28天其數(shù)量已恢復(fù)到化療前水平。NK細胞對K562細胞的殺傷活性在S1期較S0期略有下降,至S2期則較S0期略有上升,但其殺傷活性在S1、S2、S3期與 S0期相比均未達到統(tǒng)計學(xué)差異水平。我們未發(fā)現(xiàn)化療后NK細胞殺傷活性顯著上升,這也可能是由于樣本量較小的緣故。

綜上所述,晚期卵巢癌患者實施紫杉醇、卡鉑聯(lián)合化療后,其體內(nèi)免疫細胞經(jīng)歷先降低、后增殖的免疫重建過程。CD8+T細胞的應(yīng)答能力在化療后12～14天顯著增強;此外化療后NK細胞的殺傷功能無明顯變化?；熀竺庖咧亟ㄕT生了增強的抗腫瘤免疫應(yīng)答,免疫重建期可能是免疫治療實施的最佳窗口期。

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[收稿2009-06-03 修回2009-08-29]

（編輯 張曉舟）

The dynam ic changes in the numbersand functions of CD8+T cellsand NK cells in advanced ovarian cancer patients undergoing first line chemotherapy

FENGQin-Mei,DIWen,WUXia.DepartmentofObstetrics&Gynecology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,Shanghai JiaotongUniversity,Shanghai200127,China

Objective:The purpose of this study is to investigate the dynam ic changes in the numbersand functions of CD8+T cells and NK cellsin patientswith advanced ovarian cancer undergoing first line chemotherapy,so as to identify whether therewas a“window period” of anti-tumor immune suppression reverse after chemotherapy.Methods:Peripheralblood samp lesfrom each ovarian cancer patientwere obtained before（S0）and at day 5-7（S1）,day 12-14（S2）and day 25-28（S3）after chemotherapy in 13 patients.The numbers and proportions of CD3+,CD4+,CD8+and nature killer（NK）cells were analyzed by flow cytometry technique.The percentages of specific IFN-γ-secreting CD8+cellswere also calcu lated after that peripheral lymphocytes had been stimu lated with self tumor lysates.Cytotoxicity of NK cells against K562 cellswas detected by LDH releasing assay.Results:The numbers of CD3+,CD4+,CD8+T cells and NK cells reduced to the lowest on S1.Compared to thoseof the controlgroup,and the percentagesof IFN-γ-secreting CD8+T cellswere remarkably higher on S1,S2and S3when CD8+T cellswere stimulatedwith autologous tumor antigen,and the percentageof CD8+IFN-γ+cell reached the higheston S2.No significant differences ofNK cell cytotoxicity against K562 cellswere found on S1,S2and S3compared to S0.Conclusion:Paclitaxeland carboplatin induce lymphopenia,which triggers the temporary immune reconstitution.During immune reconstitution the enhanced priming of CD8+T cell response by autologoustumor antigen is found while the function of NK cells does not change significantly.Itprobably turnsout that the “window period”during immune reconstitution offers abest opportunity for cancer immunotherapy.

Ovarian cancer;Chemotherapy;CD8+T cell;NK cell

R730

A

1000-484X（2010）01-0023-06

①本文為國家自然科學(xué)基金（30801363）、上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目（08YZ43）

②通訊作者,E-mail:wuxia1225@yahoo.com.cn

馮勤梅（1971年-）,女,博士,主治醫(yī)師,主要從事婦科腫瘤研究,目前于山西省人民醫(yī)院婦科工作。

·神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫·