杜耀武 柴立輝 黃紅瑩 白慧玲 趙粵萍 馬遠(yuǎn)方
(河南大學(xué)免疫學(xué)研究所河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院河南大學(xué)天然藥物與免疫工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,開封 475001)
抗人DR5功能性單克隆抗體誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的線粒體途徑的分子機(jī)制①
杜耀武 柴立輝 黃紅瑩 白慧玲 趙粵萍 馬遠(yuǎn)方
(河南大學(xué)免疫學(xué)研究所河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院河南大學(xué)天然藥物與免疫工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,開封 475001)
目的:探討抗人死亡受體5(DR5)功能性單克隆抗體(mDRA-6)對(duì)Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的線粒體途徑的分子機(jī)制。方法:MTT法檢測單克隆抗體(mDRA-6)對(duì)Jurkat細(xì)胞生長抑制作用的劑量-效果及時(shí)間-效果關(guān)系;JC-1單染流式細(xì)胞術(shù)定量分析技術(shù)對(duì)凋亡的Jurkat細(xì)胞線粒體膜電位的變化進(jìn)行分析;免疫印跡技術(shù)檢測凋亡細(xì)胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞抑制具有明顯劑量-效果和時(shí)間-效果關(guān)系;流式細(xì)胞儀檢測顯示,2.0μg/m l濃度的mDRA-6作用15、30、60和120分鐘時(shí),Jurkat細(xì)胞線粒體膜電位改變率分別為 20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐漸增高趨勢(shì)。免疫印跡技術(shù)檢測顯示,mDRA-6作用后,Jurkat細(xì)胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等表達(dá)活性增加,并且Cyto c在線粒體內(nèi)為遞減而在胞漿呈遞增的表達(dá)現(xiàn)象。結(jié)論:mDRA-6通過激活外源性膜受體,繼而啟動(dòng)細(xì)胞線粒體途徑導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞凋亡。本研究為mDRA-6對(duì)白血病治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
死亡受體5;單克隆抗體;Jurkat細(xì)胞;細(xì)胞凋亡
1995年Wiley等[1]報(bào)道,腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRA IL)可與腫瘤細(xì)胞膜相應(yīng)的死亡受體(Death receptor)DR4和/或DR5結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。自此,對(duì)TRAIL及其DR4/DR5的研究一直備受關(guān)注,針對(duì)DR4及DR5的功能性單抗HGS-ETR1(Mapatumumab)和HGS-ETR2(Lexatumumab)等正在進(jìn)行臨床一期或二期實(shí)驗(yàn)研究。Hotte等以不同劑量的Mapatumumab對(duì)41例實(shí)體惡性腫瘤患者(其中結(jié)腸癌10例、卵巢癌 9例、宮頸癌5例、乳腺癌 3例、肺癌4例等)進(jìn)行治療結(jié)果表明,12位(29.3%)患者的治療有效、病情穩(wěn)定[2];Plummer等以不同劑量Lexatumumab對(duì)37例實(shí)體惡性腫瘤患者進(jìn)行治療后,13位(35.1%)患者的治療結(jié)果較好[3]。我國鄭德先教授研制的抗DR5功能性單克隆抗體AD5-10,也正在進(jìn)行抗腫瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[4]。
本實(shí)驗(yàn)室以可溶性人DR5(rhDR5)胞外段蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫獲得了抗人DR5單克隆抗體,被命名為mDRA-6[5],此抗體可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞及其它腫瘤細(xì)胞凋亡[6-8],并初步探明該抗體誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制與膜受體途徑凋亡有關(guān)[8]。本研究仍然以TRA IL敏感的Jurkat細(xì)胞株為靶細(xì)胞,探討線粒體凋亡途徑的蛋白分子機(jī)制在DRA-6誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡中意義,為mDRA-6的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步提供理論依據(jù)。
1.1 抗體和細(xì)胞系 抗人DR5單克隆抗體mDRA-6為本實(shí)驗(yàn)室制備[5];山羊抗人Caspase-8、9 IgG多克隆抗體及兔抗人Caspase-3 IgG單克隆抗體購于R&D公司;山羊抗人Bid(tbid)、Cyto c、Actin多克隆抗體,山羊抗人 BCl-2、Bax單克隆抗體購自Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊、山羊抗兔等IgG(H+L)購自北京中杉金橋公司。Jurkat細(xì)胞為TRAIL敏感株,由美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)系陳有海教授饋贈(zèng),培養(yǎng)于2mmol/L L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10mmol/LHEPES、1mmol/L丙酮酸鈉、10%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在 37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。
1.2 主要材料與試劑 RPMI 1640、胎牛血清、四氮唑藍(lán)(MTT)購自GIBCO公司;rhTRAIL、DMSO購自Sigma公司;細(xì)胞線粒體分離及膜電位檢測試劑盒(JC-1)、Western blot試劑盒及IP細(xì)胞裂解液購自Beyotime公司;ECL顯影試劑盒購自Santa Cruz公司;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)為BD公司產(chǎn)品;垂直電泳儀及電轉(zhuǎn)裝置為Thermo EC公司產(chǎn)品;凝膠圖像分析儀(Alphalmager2200)為A lpha Inntech公司產(chǎn)品;數(shù)碼相機(jī)為Nikon公司產(chǎn)品。
1.3 mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞毒作用檢測 將密度為2.0×105m l-1的Jurkat細(xì)胞加于96孔平底型細(xì)胞培養(yǎng)板,100μl/孔,培養(yǎng)8小時(shí)作對(duì)細(xì)胞增殖作用的劑量-效果的檢測。加mDRA-6液100μl,使第1孔的抗體濃度為5.0μg/ml,然后倍比稀釋依次至第2、第3……第10孔,第11孔為不加mDRA-6的陰性對(duì)照,第12孔為不加細(xì)胞的空白對(duì)照;以rhTRAIL作為對(duì)照;每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12小時(shí),1 000 r/min離心5分鐘,吸出150μl上清,加入新培養(yǎng)液130μl/孔,加MTT(5.0 mg/m l)20μl/孔,繼續(xù)孵育4小時(shí)。離心后小心移棄上清。加DMSO,150μl/孔,避光振蕩混和10分鐘,全自動(dòng)酶標(biāo)儀測OD570值。
將相同密度的Jurkat細(xì)胞加于7塊96孔平底型細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)作對(duì)細(xì)胞增殖作用的時(shí)間-效果的檢測,第1孔加入mERA-6為100μl,使其終濃度為0.5 μg/ml,第2孔為不加mDRA-6的陰性對(duì)照,第3孔為空白對(duì)照,每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔,以rhTRAIL作為對(duì)照 。繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,依次于 2、4、6、8、10、12小時(shí)取培養(yǎng)板,依照上述方法加入MTT及DMSO,全自動(dòng)酶標(biāo)儀測OD570值。
所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。計(jì)算Jurkat細(xì)胞死亡率和存活率。細(xì)胞死亡率(%)=100%-細(xì)胞存活率;細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白OD值)/(對(duì)照組OD值-空白OD值)×100%)。
1.4 線粒體膜電位(Mitochondrialmembrane potential,ΔΨm)檢測 將密度為 6.0×105m l-1的Jurkat細(xì)胞加于一組6孔板內(nèi),0.5 ml/孔,每孔加入mDRA-6,使其濃度為2.0 μg/m l,對(duì)照孔不加 。于15、30、60和120分鐘時(shí)依次收集每孔細(xì)胞,離心棄上清,加入0.5m l JC-1染色工作液,混勻后置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20分鐘。離心后棄上清,加入緩沖液1ml混勻置冰上,以流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位的變化,用CellQuest軟件進(jìn)行分析。
1.5 參與Jurkat細(xì)胞凋亡線粒體途徑的蛋白分子檢測 將密度為6.0×105ml-1的Jurkat細(xì)胞加于兩組6孔板內(nèi)0.5 ml/孔,加入mDRA-6,使其濃度為2.0μg/ml,對(duì)照孔不加。于 15、30、60和120分鐘時(shí)依次收集每孔細(xì)胞,離心棄上清,其中一組每管加入Western及IP細(xì)胞裂解液300μl充分混勻,置冰上30分鐘,10 000 r/m in低溫離心1分鐘,吸取上清;另一組以細(xì)胞線粒體分離試劑獲取每份樣品的線粒體裂解蛋白;BCA法測定每份樣品的蛋白總量,于12%~18%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離蛋白[9],隨后,將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜上,加入Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c 等一抗,與 PVDF 膜在室溫下孵育1小時(shí),以PBST(含0.1%Tween 20的PBS)洗6次,10分鐘/次。加入二抗,室溫孵育1小時(shí),以PBST洗去未結(jié)合抗體,以Kodak X-AR膠片記錄ECL法檢測結(jié)果。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和t檢驗(yàn)和方差分析,藥物作用Jurkat細(xì)胞的劑量-效果關(guān)系及時(shí)間-效果關(guān)系的分析作用采用直線回歸分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞的毒性作用[8]不同濃度的mDRA-6作用12小時(shí)后,Jurkat細(xì)胞的死亡率明顯增高,當(dāng)濃度為4.9l~1 250 ng/ml時(shí)細(xì)胞的死亡與mDRA-6呈明顯的量-效關(guān)系,見圖1A。以0.5 μg/m l的 mDRA-6 作用 2、4、6、8、10、12 小時(shí)時(shí) ,Jurkat細(xì)胞死亡率明顯增加,與mDRA-6作用時(shí)間呈明顯的時(shí)-效關(guān)系(r=0.928,P=0.008);作為對(duì)照,相同濃度的rhTRAIL作用相同時(shí)間時(shí),Jurkat細(xì)胞死亡率為 9.22%、17.39%、38.78%、47.18%、51.98%、58.08%,結(jié)果見圖1B。本檢測證明,相同濃度的mDRA-6及rhTRAIL作用于Jurkat細(xì)胞時(shí),無論從量-效關(guān)系,還是從時(shí)-效關(guān)系上比較,mDRA-6誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果高于rhTRAIL。
2.2 mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞線粒體膜電位(ΔΨm)的影響經(jīng)JC-1單染后流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果顯示,以2.0μg/m l的mDRA-6作用Jurkat細(xì)胞15、30分鐘和1、2小時(shí)后,Jurkat細(xì)胞線粒體膜電位下降率分別為20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,提示 mDRA-6可以導(dǎo)致線粒體膜電位降低,見圖2。
2.3 mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 以2.0μg/m l的mDRA-6作用后,Western blot法檢測 Jurkat細(xì)胞Caspase-8、3、9 及 Bid 、Bax、Bcl-2、Cyto c表達(dá)結(jié)果顯示 ,Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平明顯增強(qiáng);Bid酶原、Bcl-2隨作用時(shí)間的延長表達(dá)水平逐漸減少、而激活的tbid、Bax和Cyto c表達(dá)水平逐漸增加,而線粒體內(nèi)的Cyto c逐漸減少,證明Cyto c隨著作用時(shí)間的延長由線粒體基質(zhì)外溢至胞漿中,佐證了JC-1單染線粒體膜電位(ΔΨm)的變化,見圖3。
自Wiley等報(bào)道TRAIL之后的十多年間,針對(duì)促凋亡受體激動(dòng)劑(Proapoptotic receptor agonists,PARAs)的研究一直是方興未艾,目前文獻(xiàn)報(bào)道的針對(duì)DR4/DR5的功能性抗體約有8個(gè)[10],有的已經(jīng)用于臨床Ⅰ期試驗(yàn),并取得了一定的療效[2-4]。mDRA-6是本實(shí)驗(yàn)室研制的針對(duì)人DR5的功能性單克隆抗體,與rhDR4、rhDcR1、rhDcR2和 rhFas等無交叉反應(yīng),能與腫瘤細(xì)胞膜表面的DR5結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo)凋亡作用可以被 rhDR5完全阻斷[5]。mDRA-6無需交聯(lián)即可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,并與化療藥物具有協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[11,12]。
圖1 mDRA-6、rhTRAIL對(duì)Jurkat細(xì)胞死亡率Fig.1 The dose-dependence and time-dependence of Jurkat cell death treated bymDRA-6&rhTRAIL
圖2 mDRA-6誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞調(diào)亡的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Fig.2 Analysis Jurkat cellapoptosis treated bymDRA-6 with JC-1 stain by FCM
圖3 Western blot檢測mDRA-6作用 Jurkat細(xì)胞相關(guān)凋亡信號(hào)的結(jié)果Fig.3 Activation of caspase cascade and apoptotic proteins were tested by Western b lot
我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mDRA-6可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡[8],可使 Jurkat細(xì)胞 Caspase-8、3、9 均被激活,Caspase-8抑制劑對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的抑制作用遠(yuǎn)高于Caspase-3、9抑制劑的作用[8]。初步證實(shí),mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞的凋亡作用與其它已知的DR5的功能性單抗AD5-10、TRA-8等具有相似的膜受體凋亡機(jī)制[4,13]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上,對(duì)分析了對(duì)Jurkat細(xì)胞線粒體膜電位改變的分析,免疫印跡顯示 Bid(tbid)、Bax、Bcl-2、Cyto c等與線粒體途徑凋亡相關(guān)的蛋白分子的變化情況。
線粒體膜電位(ΔΨm)的下降是細(xì)胞早期凋亡的一個(gè)標(biāo)志。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物(J-aggregates),產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體(monomer),產(chǎn)生綠色熒光。所以,用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測指標(biāo)。當(dāng)以2.0μg/ml的mDRA-6作用15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)后,Jurkat細(xì)胞線粒體膜電位下降率分別為20.14%、19.34%、21.11%、30.90%(見圖 2),此結(jié)果與mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞毒性作用的量-效關(guān)系及時(shí)-效關(guān)系的結(jié)果分析不一致,遠(yuǎn)低于相當(dāng)劑量時(shí)Jurkat的細(xì)胞死亡率,提示mDRA-6在通過降低線粒體膜電位引起細(xì)胞凋亡的同時(shí),還有其它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑[8]。
蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,隨著mDRA-6的作用時(shí)間延長,Caspase-8、3、9和Bax活性片段表達(dá)均呈現(xiàn)漸進(jìn)式增加,在120分鐘時(shí)活性片段表達(dá)最強(qiáng)。Bid(tbid)Bid酶原表達(dá)逐漸減少、而激活的tbid表達(dá)逐漸增加,對(duì)凋亡有抑制作用的Bcl-2表達(dá)逐漸減少、而對(duì)凋亡起促進(jìn)作用的Bax卻表達(dá)逐漸增多;同時(shí),Cyto c表達(dá)增加,在120分鐘時(shí)表達(dá)最強(qiáng),而線粒體內(nèi)的Cyto c表達(dá)逐漸減少,在120分鐘處幾乎沒有表達(dá),提示隨著mDRA-6對(duì)Jurkat細(xì)胞作用時(shí)間延長,Cyto c由線粒體基質(zhì)大量外溢至胞漿中,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡(見圖3)。
細(xì)胞凋亡主要通過兩種既獨(dú)立又彼此相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制:一種是外源性的膜受體途徑,通過激活細(xì)胞膜表面的凋亡受體;另一種是內(nèi)源性的線粒體途徑,通過激活細(xì)胞內(nèi)的線粒體信號(hào)。這兩者匯集于效應(yīng)分子Caspases,協(xié)調(diào)引導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。對(duì)由Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain,FADD)及Caspase-8和/或Caspase-10啟動(dòng)的腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中,發(fā)現(xiàn)有兩種不同類型的凋亡機(jī)制在相應(yīng)的細(xì)胞中起重要作用。Ⅰ型細(xì)胞中Caspase-8和/或Caspase-10作用于Caspase-3的二聚體酶原結(jié)構(gòu)而引起Caspase-3活化[15],激活的Caspase-3消化分解包括ICAD(Inhibitorof Caspase-activated deoxyribonuclease)在內(nèi)的構(gòu)成細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)的多種蛋白成分,而ICAD的破壞導(dǎo)致CAD的活化,后者引起細(xì)胞DNA降解,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。Ⅱ型細(xì)胞中,可能因凋亡抑制蛋白XIAP(X-chromosome linked Inhibitory of Apoptosis Protein)的影響使Caspase-3不能被有效地激活、啟動(dòng)凋亡進(jìn)程,從而通過Caspase-8和/或Caspase-10啟動(dòng)了BID(Bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein,BID)激活為活性狀態(tài)的tbid[17],與Bax(Bcl-2-associated X protein)共同插入線粒體外膜層,使線粒體內(nèi)膜亦破壞崩解而引起Cyto c等外溢[18],再與Apaf-1(Apoptotic protease activating factor 1)、Pro-caspase-9和dATP形成一種被稱之為apoptosome的復(fù)合體,這種復(fù)合體二聚化再激活Caspase-9,進(jìn)一步放大Caspase-3的激活而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,mDRA-6誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡的過程中,通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有很重要的作用。mDRA-6首先作用于細(xì)胞膜表面的DR5,激活受體形成三聚體進(jìn)而募集細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)接分子Pro-caspase-8,使后者進(jìn)一步成為活化狀態(tài)的Caspase-8,通過外源性的膜受體凋亡途徑進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)分子Caspase-3、9,繼而作用于死亡底物發(fā)生凋亡。同時(shí),活化的Caspase-8激活Bid形成有活性的tbid,在促進(jìn)凋亡的Bax分子參與下,消減抗凋亡分子Bcl-2對(duì)線粒體膜的穩(wěn)定作用,破壞線粒體膜的完整性,引起線粒體膜電位下降,導(dǎo)致Cyto c由線粒體基質(zhì)外溢至胞漿中而促使細(xì)胞的凋亡。本研究及我們的前期工作提示,mDRA-6誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與mDRA-6首先激活外源性的膜受體途徑,繼而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性的線粒體途徑[8],通過細(xì)胞凋亡的兩種途徑導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞凋亡的。詳細(xì)機(jī)制參見圖4。
mDRA-6誘導(dǎo) Jurkat細(xì)胞凋亡過程中,有無JUK/P38/PARP途徑的參與,Smac/DIABLO 、P53、NF-κB等分子的表達(dá)如何仍不清楚,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)??谷薉R5的功能性單克隆抗體mDRA-6是一種具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性的功能性抗體,將其人源化改造后可有效地用于抗腫瘤生物治療,可為TRAIL/DR5系統(tǒng)的抗腫瘤應(yīng)用提供一種新的生物治療制劑。
圖4 mDRA-6誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制示意圖Fig.4 Themolecu lar mechanisms of mDRA-6 inducing apoptosis in Jurkat cells
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[收稿2009-06-07 修回2009-09-24]
(編輯 許四平)
Them itochondrial-dependentmolecular mechanisms for inducing apoptosis in Jurkat cellsby a novelagonistic anti-human DR5monoclonal antibody
DUYao-Wu,CHAILi-Hui,HUANGHong-Ying,BAIHui-Ling,ZHAOYue-Ping,MAYuan-Fang.InstituteforImmunologyofHenanUniversity,MedicalCollegeofHenanUniversity,TheKeyLaboratoryofNaturalDrug&ImmunologyEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475001,China
Objective:To investigatemitochondrial-dependentmolecularmechanisms of a novel agonistic anti-human death receptor 5(DR5)monoclonal antibody(mDRA-6)inducing apoptosis in Jurkat cell.Methods:The dose-dependent and time-dependent cellgrow th suppression ofmDRA-6 in Jurkat cellswas determined by MTT assay.Themeasurement of them itochond rial transmembrane potential(ΔΨm)of Jurkat cellswasdetected by flow cytometrywith JC-1 single staining.Caspase-8,9 aswell as Bid,Bax,Bcl-2 and Cyto c of apoptotic Jurkat cells were analyzed byWestern blotaftermDRA-6 treatment.Results:ThemDRA-6 induced cellgrow th suppression and cytotoxicity in dose-dependentmanner and time-dependentmanner.AftermDRA-6 treatment at2.0μg/ml for15min,30min,60min and 120min,the change inΔΨm were 20.14%,19.34%,21.11%and 30.90%respectively by JC-1 single staining.Western blot revealed that the levelofactive fragmentsof Caspase-8,9 and Bid,Bax,Bcl-2 and Cyto c respectively,and the amountof Cyto cwasincreased in cytosol concomitantwith the related attenuation of Cyto c inmitochondria.Conclusion:Apoptotic pathway of Jurkat cells induced bymDRA-6 is initiated upon DR5 ligation tomDRA-6 and exogenic Caspase-dependent cell apoptotic cascades is activated,and endogenicmitochondrial-dependent cell apoptosis pathway is activated.mDRA-6may be ausefu lagent in investigating human leukemia therapy by using TRAIL/DR5.
Death recptor5;Monoclonal antibody;Jurkat cell;Apoptosis;Western blot
R392.11
A
1000-484X(2010)01-0003-05
①本文受國家863重大專項(xiàng)子課題(No.2006AA02A 254)及河南省杰出人才創(chuàng)新基金項(xiàng)目(No.074200510014)的資助
杜耀武(1971年-),男,醫(yī)學(xué)碩士,副教授,主要從事腫瘤免疫學(xué)研究,E-mail:dyw711@henu.edu.cn;
及指導(dǎo)教師:馬遠(yuǎn)方(1960年-),男,醫(yī)學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤免疫與抗體工程研究,E-mail:mayf@henu..edu.cn。