博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化造模方式的選擇

李麗娜 王 華 周 蕾 張永勝 于永利 王麗穎 孫陸果

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室,長(zhǎng)春 130021）

博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化造模方式的選擇

李麗娜 王 華 周 蕾 張永勝 于永利①王麗穎 孫陸果

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室,長(zhǎng)春 130021）

目的:建立博萊霉素導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化小鼠動(dòng)物模型,比較不同給藥方式的成模差異。方法:利用8周齡雄性ICR小鼠,①隨機(jī)分為腹腔給藥組（P組）、氣管內(nèi)給藥組（I組）、陰性對(duì)照組（C組）,分別經(jīng)腹腔注射BLM 40mg/kg 5次、氣管內(nèi)滴入BLM 5mg/kg 1次或氣管內(nèi)滴入生理鹽水50μl。分別于14、28、40天處死,②小鼠隨機(jī)分為4組,分別經(jīng)腹腔注射BLM 40 mg/kg3、4、5次或經(jīng)腹腔給予生理鹽水200μl。分別于28、40天處死。觀察小鼠體重、咳嗽、撓鼻癥狀、肺系數(shù)及肺組織病理改變。結(jié)果:給予博萊霉素后①小鼠的體重均下降并出現(xiàn)咳嗽及撓鼻等呼吸障礙癥狀;處置后第14、28及40天處死小鼠,計(jì)算肺系數(shù),P組較I組肺系數(shù)高;處死小鼠后,P組和I組小鼠均形成廣泛、穩(wěn)定的間質(zhì)纖維化病理改變,P組主要分布在胸膜下及血管周圍,而I組主要分布在肺門和支氣管周圍。P組較I組肺纖維化病理評(píng)分高。②不同腹腔給藥次數(shù)模型小鼠體重變化以5次給藥對(duì)體重影響最大;計(jì)算肺系數(shù)以給藥5次肺系數(shù)變化最大。上述模型均成功建立。通過(guò)比較生存率、呼吸困難癥狀、組織病理變化等指標(biāo),選出腹腔給藥5次相對(duì)于給藥3次及4次為更好的造模方式。結(jié)論:利用BLM腹腔注射和氣管內(nèi)滴入制備了肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型,纖維化形成的部位存在著一定的差異,腹腔給藥5次方法制備肺間質(zhì)纖維化模型的成功率更佳。

ICR小鼠;博萊霉素;肺間質(zhì)纖維化

肺纖維化一般指在毒物、自發(fā)免疫反應(yīng)、藥物副反應(yīng)、感染、嚴(yán)重的外傷等不同因素刺激下引起肺部炎癥反應(yīng),肺泡持續(xù)性損傷、細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞、修復(fù)、重建并過(guò)度沉積,導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的一類疾病,是所有間質(zhì)性肺疾病的終末結(jié)局,其發(fā)生、發(fā)展關(guān)系到這一大類疾病的研究進(jìn)展。目前我國(guó)還沒(méi)有明確的流行病學(xué)調(diào)查資料,美國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查顯示18～34歲人群的特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（Idiothomeol pulmonary fibrosis,IPF）,患病率約為7/10萬(wàn),75歲以上人群的IPF患病率為227.2/10萬(wàn),年發(fā)病率約為1.2～76.4/10萬(wàn)[1]。主要表現(xiàn)逐漸加重的呼吸困難,伴有刺激性干咳,病情一般持續(xù)發(fā)展,最終因呼吸衰竭而死亡;至今無(wú)有效的藥物能逆轉(zhuǎn)肺纖維化的自然過(guò)程及其終末結(jié)局;預(yù)后差,確診后平均生存時(shí)間2～3年。

博萊霉素是從鏈霉菌屬中一個(gè)產(chǎn)抗生素株中提取出的糖肽類物質(zhì)。臨床上,博萊霉素常用于治療淋巴瘤、辜丸癌、鱗狀細(xì)胞癌等。使用博萊霉素早期可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)及類似肺炎癥狀,而后期則產(chǎn)生進(jìn)行嚴(yán)重的肺纖維化[2]。由于其導(dǎo)致動(dòng)物肺間質(zhì)纖維化模型與人類肺間質(zhì)纖維化病理過(guò)程相似,所以常被用來(lái)制作肺纖維化的動(dòng)物模型。為建立一種比較適合肺纖維化發(fā)病及治療的造模方式,先后有學(xué)者選用了腹腔給藥、氣管滴入、尾靜脈給藥及霧化吸入等方法[3-6],但尾靜脈給藥法成模率較低,霧化吸入法成本較高,因此本研究比較了腹腔、氣管給予博萊霉素及經(jīng)腹腔給予不同劑量的博萊霉素建立肺間質(zhì)纖維化模型的效果,以選用最為簡(jiǎn)便及成模率高的方式從而進(jìn)行下一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SPF級(jí)ICR小鼠,8周齡,體重18～22克,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。博萊霉素粉劑每支8mg（哈爾濱博萊制藥有限公司）,戊巴比妥鈉由Serva進(jìn)口分裝。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 小鼠飼養(yǎng)于IVC鼠籠中,室溫（24℃～26℃）,保持濕度,日照 14小時(shí)和黑夜10小時(shí)交替進(jìn)行,墊料、食物和水滅菌處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不限制食水。具體造模方法:氣管給藥組（I組）實(shí)驗(yàn)小鼠用4%水合氯醛（0.01m l/g）150μl腹腔注射麻醉后,取仰臥固定位,常規(guī)消毒,行頸正中切口,鈍性分離暴露氣管,于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺緩緩注入BLM（5mg/kg）0.05 ml,。注藥后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn)3～5分鐘,使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi),然后縫合皮膚,并在縫合處消毒,待清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。手術(shù)前一日及術(shù)后三天連續(xù)肌肉注射青霉素（0.05 m l/只）。腹腔給藥組于實(shí)驗(yàn)0、2、4、6、8天于腹膜腔注射BLM（40mg/kg）200μl 3、4或5次,C組注入等體積生理鹽水,P 組分別于實(shí)驗(yàn)0、2、4、6、8 天于腹膜腔注射BLM（40mg/kg）200μl。

1.2.2 小鼠體重監(jiān)測(cè) 測(cè)量每只小鼠每日體重,記錄體重變化,并觀察小鼠毛色、活動(dòng)狀態(tài)等變化。

1.2.3 觀察小鼠咳嗽及撓鼻癥狀 記錄每5分鐘每只小鼠咳嗽及撓鼻次數(shù)。

1.2.4 計(jì)算肺系數(shù) 各組小鼠分別于給藥后第14、28、40天采用摘除眼球造成急性大量失血的方法處死,分離出雙肺,分離干凈后放入冰冷生理鹽水中漂洗除去血液,用濾紙洗凈表面的血液后,稱肺重,按如下公式計(jì)算肺系數(shù):肺系數(shù)=肺濕重（mg）/體重（g）。

1.2.5 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺下葉,4%中性福爾馬林固定一夜后,按常規(guī)病理學(xué)方法脫水、包埋、切片、分別進(jìn)行HE染色及Masson染色。染色后切片參照Szapiel[7]方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。具體如下:1）肺泡炎:分為4級(jí)①無(wú)肺泡炎0分;②輕度肺泡炎l分:單核細(xì)胞浸潤(rùn)使肺泡隔增寬,僅限于局部和近胸膜部,面積小于全肺的20%,肺泡結(jié)構(gòu)正常;③中度肺泡炎2分:受累面積占全肺的20%～50%,近胸膜部較重;④重度肺泡炎3分:面積大于50%,偶見肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成的實(shí)變。2）肺纖維化:①無(wú)肺纖維化0分;②輕度肺纖維化1分:受累面積＜20%;③中度肺纖維化2分:受累面積20%～50%;④重度肺纖維化 3分:受累面積＞50%,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

2 結(jié)果

2.1 氣管給藥與腹腔給藥兩種造模方式比較

2.1.1 小鼠生存率比較 BLM注射處置后,P組小鼠無(wú)死亡,生存率為100%;而I組小鼠生存率為50%,死亡主要發(fā)生在1～10天。兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P＜0.05）。

2.1.2 小鼠體重變化 造模后小鼠體重開始下降,以0～6天明顯。P組小鼠體重下降5克,I組小鼠體重下降3克,第6天后模型組小鼠體重變平穩(wěn),而I組小鼠體重在14天后逐漸上升。各組小鼠體重標(biāo)準(zhǔn)差比較發(fā)現(xiàn):C組及I組標(biāo)準(zhǔn)差較大,而P組個(gè)體間差異較小。以各組小鼠平均體重及標(biāo)準(zhǔn)差作圖如下,見圖1。

2.1.3 小鼠呼吸系統(tǒng)癥狀比較 造模后小鼠出現(xiàn)咳嗽及撓鼻等呼吸障礙表現(xiàn)。每日上午同一時(shí)間計(jì)數(shù)每只小鼠5分鐘內(nèi)咳嗽及撓鼻次數(shù)。統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn):C組小鼠無(wú)咳嗽及撓鼻,P組癥狀較I組重,模型組癥狀在28天后逐漸減輕,但并未消失。見圖2。

2.1.4 各組小鼠肺系數(shù)比較 小鼠處死后依照公式計(jì)算肺系數(shù),結(jié)果顯示各時(shí)間段腹腔給藥方式造模小鼠的肺系數(shù)均較氣管給藥組肺系數(shù)高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P組與I組40天處死小鼠肺系數(shù)之間比較P＜0.05,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。提示腹腔給藥方式造模40天時(shí)小鼠纖維化程度較氣管給藥組重。見圖3。

2.1.5 肺臟病理變化 腹腔注射法形成的纖維化改變主要分布于胸膜下及血管周圍,氣管滴入法主要分布在支氣管、細(xì)支氣管周圍,尤其以近肺門處更為明顯。兩組病理評(píng)分與比陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）,而兩組之間比較差異不顯著。見圖4。

圖1 兩種給藥方式小鼠體重變化Fig.1 Different medicine given way induced the change of m ice'sweight

圖2 癥狀比較Fig.2 Symp tom comparison

圖3 肺系數(shù)比較Fig.3 Pulmonary system of different adm ission method

2.2 篩選腹腔給予博萊霉素造模的給藥次數(shù) 進(jìn)一步摸索腹腔注射博萊霉素的給藥次數(shù),選用了24只雄性SPF級(jí)ICR體重18～22克小鼠,隨機(jī)分為4組 ,于實(shí)驗(yàn) 0、2、4、6、8 天于腹膜腔注射 BLM（40mg/kg）200μl3、4或5次,陰性對(duì)照組同時(shí)給予同體積生理鹽水。觀察小鼠體重及肺系數(shù)變化。

圖4 病理評(píng)分比較Fig.4 Comparison of patho-score

圖5 不同給藥次數(shù)體重變化比較Fig.5 W eight changeby different adm ission times

圖6 不同給藥次數(shù)肺系數(shù)變化Fig.6 Pu lmonary system change which were induced by different bleomycin adm ission

2.2.1 體重變化比較 給予BLM后均低于陰性對(duì)照組,隨著給藥次數(shù)的增加,小鼠體重增加速度明顯減慢,最明顯為給藥5次組。見圖5。

2.2.2 肺系數(shù)的變化 于實(shí)驗(yàn)第28及40天處死小鼠,比較各組肺系數(shù)。隨給藥次數(shù)增加,小鼠肺系數(shù)逐漸增高,以給藥5次最高。見圖6。

2.2.3 成模率比較 三種給藥次數(shù)小鼠分別于開始造模后28天或40天處死,第40天以5次給藥組小鼠成模率最高,為100%,而4次及3次給藥分別為80%及60%,相比較而言5次給藥成模率更高。

3 討論

BLM是一種細(xì)胞毒性抗癌藥物,具有致肺纖維化的副作用,因而常被用來(lái)制備肺纖維化動(dòng)物模型。ICR小鼠腹腔注射BLM 40mg/kg,可形成廣泛的肺間質(zhì)纖維化[3]。BLM 5mg/kg氣管內(nèi)注射也是制備這種模型的常用方法。本研究利用ICR小鼠,探討制備肺間質(zhì)纖維化模型的異同點(diǎn)并比較不同腹腔給藥次數(shù)造成小鼠肺間質(zhì)纖維化病變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),氣管注射法有較高的死亡率（50%）,小鼠的死亡發(fā)生在6～9天,這與其他研究結(jié)果相似[3,6]。而腹腔注射在本實(shí)驗(yàn)中未造成小鼠死亡。肺組織病理結(jié)果顯示,腹腔注射法形成的纖維化改變主要分布于胸膜下及血管周圍,與Harrison[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。氣管滴入法主要分布在支氣管、細(xì)支氣管周圍,尤其以近肺門處更為明顯,這與Ekimoto[8]報(bào)道的結(jié)果相似。氣管滴入及腹腔注射兩種小鼠肺纖維化改變的分布存在著明顯的不同,這種表現(xiàn)推測(cè)與兩種方法注射后,BLM在肺組織局部的分布濃度不同有關(guān)。靜脈注射BLM后,可能由于肺門處血流速度較快,而肺外周流速明顯減慢,所以其在肺周邊更容易形成明顯的纖維化病理改變,模型形成晚,需要40天,更接近臨床。而氣管內(nèi)注射BLM后,藥物經(jīng)支氣管上皮吸收后,可能在支氣管周圍局部形成BLM濃度較高區(qū)域,所以在支氣管周圍特別是臨近肺門處而不是周邊肺組織形成明顯的纖維化改變。比較3種不同腹腔注射博萊霉素次數(shù)的小鼠模型,注射5次的小鼠體重及肺系數(shù)變化更為明顯,為腹腔注射博萊霉素的更好方式。

在本研究中發(fā)現(xiàn)氣管給藥與腹腔給藥均能成模。采用腹腔注射BLM制作小鼠肺纖維化動(dòng)物模型,操作簡(jiǎn)便、快捷、個(gè)體間差異小,可以減輕因手術(shù)操作熟練程度的不同造成的纖維化程度不同。在操作過(guò)程中注意使小鼠處于頭低腳高位,以避免腹腔臟器的副損傷。模型的形成可能與藥量有關(guān),腹腔給藥3次組,體重已有變化,但不足以造成嚴(yán)重的病理變化,5次給藥更容易成模。氣管內(nèi)注射BLM,需麻醉小鼠后手術(shù)剖開頸部皮膚,鈍性分離肌肉組織充分暴露氣管,有一定感染及術(shù)中副損傷造成小鼠死亡的危險(xiǎn)性,盡量減少操作時(shí)間、減少組織損傷,有可能減少死亡的風(fēng)險(xiǎn)。

用BLM復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型被認(rèn)為是最近似于特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）病理改變的模型[5]。腹腔注射法形成的病變主要分布于胸膜下,接近人類特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的影像學(xué)表現(xiàn),而氣管滴入法主要分布在支氣管、細(xì)支氣管周圍,所以腹腔注射法與臨床IPF病理分布更為接近。本研究提示,靜脈和氣管內(nèi)注射BLM復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型,不僅在肺組織纖維化病理改變的分布上存在差異,而且成模率高,小鼠死亡率低。比較3個(gè)不同的腹腔給予博萊霉素的劑量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示根據(jù)對(duì)體重、肺系數(shù)及成模率比較及對(duì)小鼠藥物其他毒性最小,給予BLM 40mg/kg 5次可以更好的復(fù)制出小鼠間質(zhì)性肺疾病的模型,更加適用于科研動(dòng)物模型的應(yīng)用。

1 Antoniou KM,AlexandrakisM G.Cytokinenetwork in pathogenesisof idiopathic pulmonary fibrosis[J].Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis,2005;22（2）:91-95.

2 Wang Q J,Wang Y J,DallasMetal.Effect of antibody againstinte grin onBleomycin induced pulmonary fibrosis in mice[J].Biochem Pharmae,2000;60（12）:1949-1958.

3 Clark JG,KostalKM,MarinoBA.Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters.An alveolar macrophage product increases fibroblast prostaglandin E2 and cyc lic adenosinemono-phosphate and suppresses fibroblast proliferation and collagen production[J].JClin Invest,1983;72（6）:2082-2091.

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[收稿2009-11-01]

（編輯 張曉舟）

Comparison of mouse lung fibrosis induced by intraperitoneal injection and intratracheal instillation of bleomycin

LILi-Na,WANGHua,ZHOULei,ZHANGYong-Sheng,YUYong-Li,WANGLi-Ying,SUNLu-Guo.Departmentof MolecularBiology,NormanBethuneMedicalCollege,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To study the differences of bleomycin-induced pu lmonary fibrosis inmice induced by intraperitoneal in jection and intratracheal instillation of bleomycin.Methods:ICRmice（male,8w of age,18 to22 gbodyweight）wereused.①ICRmicewere randomly divided into three groups.In the group P,bleomycin was injected intraperitoneal five times in a dose of 40 mg/kg,and in the group I,bleomycin was instilled intratracheally in a doseof5mg/kg.Themicewere killed at14,28 or40 day.②ICRm icewere randomly divided into fourgroups:bleomycinwas injected intraperitoneal three,fouror five timesin a doseof40mg/kg,and in thegroup control,bleomycinwasinjected intraperitoneal in a dose of 200μl for five times.Themice was killed at28 or 40 day.The pathological changes and symptomswere observed.Results:①Theweightof themice given blemycinewere lostafter injection.Symptomsweremore serious in group P than thoseof group I.The pulmonary coefficient of group Pwasmore than thatofgroup I.At28 day after injection,fibrosiswaswidely and stably formedmainly in around thebronchiaand bronchioles,especially,near the pu lmonary hilararea,in thegroup Imice,however,the same changesweremainly seen under the pleura or perivascular pulmonary tissues in themice of group P.The pathological score of pulmonary fibrosiswas different between those twogroups.②Different dose of bleomycine induced different change of themouse'sweight.Themostof all of the three groupwere five time injection;The lung index of five time injection of bleomycine was themost.The pulmonary fibrosismousemodelwasmade successfully.After comparising all of the data,we found intraperitonealofbleomycine five timeswas themore convenientmethod.Conclusion:The sites of pu lmonary fibrosis in themice are differentbetween themice induced by intraperitoneal injection or intratracheal instillation of bleomycin.Intraperitoneal in jection five times is amore convenientmethod tomake pulmonary fibrosis.

ICRmouse;Bleomycin;Pulmonary fibrosis

R563.1

A

1000-484X（2010）03-0254-04

①吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,長(zhǎng)春130021

李麗娜（1976年-）,女,在讀博士,主治醫(yī)師,講師,主要從事肺纖維化方面發(fā)病機(jī)理及治療方面研究。

·臨床免疫學(xué)·