癌迪針劑對荷瘤小鼠免疫功能的影響①

艾金霞 劉 良 （北華大學醫(yī)學院免疫教研室,吉林 132013）

癌迪針劑對荷瘤小鼠免疫功能的影響①

艾金霞 劉 良②（北華大學醫(yī)學院免疫教研室,吉林 132013）

目的:研究癌迪針劑對腫瘤的作用效果及其抗腫瘤免疫效應機制。方法:選用H22肝癌荷瘤小鼠注射癌迪針劑7天后,觀察荷瘤小鼠腫瘤抑制率、胸腺、脾臟指數(shù)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能、腹腔巨噬細胞吞噬功能、TNF活性、IL-2及血清IFN-α水平。結(jié)果:癌迪針劑可明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長;能提高荷瘤小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能;可增強巨噬細胞吞噬活性和TNF活性;能提高IL-2和IFN-α水平。結(jié)論:癌迪針劑能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長,增強機體的免疫功能。

癌迪針劑;抗腫瘤;免疫功能

癌迪針劑為中藥一類新藥,成分澳洲茄胺鹽酸鹽,本品為粉針劑,X-射線衍射等十一項檢測,確定分子結(jié)構(gòu)為SBHL（帶碼）、分子量為:450.10,樣品純度為:大于99.2%。澳洲茄胺鹽酸鹽是從龍葵濃縮果汁中提取出的一種游離的生物堿鹽酸鹽。近幾年研究報道澳洲茄胺鹽酸鹽不但具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用,還具有抑制核糖核酸的合成、代謝,誘導細胞分化等機制發(fā)揮其抗腫瘤作用[1,2]。本實驗用移植性腹水型肝癌（H22）荷瘤小鼠做實驗,探討癌迪針劑對機體免疫功能的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品 癌迪針劑由北華大學生物與化學學院劉良教授提供,為白色粉末。

1.2 動物及瘤株

1.2.1 動物 BALB/c小鼠（20±2克）由長春高新醫(yī)學動物實驗研究中心提供,雌雄各半。

1.2.2 瘤株 移植性腹水型肝癌（H22）細胞株由長春生物制品研究所提供。

1.3 儀器及試劑

1.3.1 儀器 YJ-875超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）;DG-3022酶聯(lián)免疫測定儀（華東電子醫(yī)療設備廠）;CO2培養(yǎng)箱:美國杜邦公司產(chǎn)品。

1.3.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基由美國Invitrogen公司提供;小牛血清購自杭州四季青生物有限公司;IFN-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自華美生物工程公司;環(huán)磷酰胺（CTX）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號06050821）;分析純二甲基亞砜（DMSO）為金山化工廠產(chǎn)品。

1.4 腫瘤模型的建立 將接種腫瘤細胞后7天生長良好的小鼠,頸椎脫臼處死,置75%的酒精中浸泡10分鐘,置超凈工作臺,從移植性腹水型肝癌（H22）腫瘤小鼠腹腔內(nèi)抽取腹腔瘤液,鏡檢,用無菌生理鹽水按1∶4比例配制成癌細胞懸液（2×106ml-1）。將該腫瘤細胞懸液對實驗小鼠進行造模,每只小鼠右腋窩皮下接種0.2m l。以上均在無菌環(huán)境中操作。

1.5 分組及給藥 設6組,每組10只,雌雄各半。設一組為不接種瘤株的生理鹽水正常對照組;余50只小鼠每只右腋皮下接種0.2ml癌細胞懸液,24小時后隨機分為5組,即荷瘤對照組,環(huán)磷酰胺對照組及癌迪針劑11、33、55mg/kg 3個劑量組。正常對照組和荷瘤空白對照組用生理鹽水給予尾靜脈注射,環(huán)磷酰胺對照組給予尾靜脈注射環(huán)磷酰胺20mg/kg,連續(xù)給藥7天,癌迪針劑3個劑量組于接種第2天開始尾靜脈注射,每天1次,連續(xù)10天,第11天處死小鼠。

1.6 測腫瘤抑制率 停藥后第2天處死小鼠,剝離完整腫瘤組織,電子天平稱量瘤體濕重（精確到0.01 g）并計算腫瘤生長抑制率,抑瘤率（%）=（荷瘤對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/荷瘤對照組平均瘤重×100%。腫瘤組動物平均質(zhì)量小于1表示腫瘤生長不良,實驗組小鼠死亡率超過20%表示藥物所致毒性。

1.7 對小鼠免疫器官的影響 給藥結(jié)束后次日解剖小鼠取出胸腺、脾臟,計算臟器重量、臟器指數(shù),臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000。

1.8 對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響 處死30分鐘前,每鼠腹腔注射2%CRBC 0.5ml,立即取腹腔液滴片,甲醇固定,Giemsa染色,顯微鏡下計數(shù)200個巨噬細胞,檢測吞噬百分率和指數(shù)[3]。

1.9 小鼠脾細胞懸液的制備 將小鼠處死,取脾臟,研磨,沙網(wǎng)過濾（200目）,加入紅細胞裂解液,裂解3分鐘,1 500 r/min離心8分鐘,取出淋巴細胞,生理鹽水沖洗2次,800 r/min離心10分鐘,用RPM I1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為5×106ml-1,37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng),備用。

1.10 對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響 將制備的小鼠脾細胞懸液用RPM I1640培養(yǎng)液制成2×107m l-1細胞懸液,每孔1m l分裝到24孔培養(yǎng)板中,每孔加入ConA 3μg,置于CO2培養(yǎng)箱37℃孵育56小時后,加入[3H]TdR達終濃度37 kBq·m l-1后繼續(xù)置CO2培養(yǎng)箱孵育16小時后,將各孔細胞收集到玻璃纖維紙上,置FJ-2100型液體閃爍計數(shù)器測定并計算dpm值[4]。

1.11 TNF活性測定 將制備的小鼠脾細胞懸液用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106m l-1,接種于24孔培養(yǎng)板,每孔500μl,每孔再加終濃度為 5μg/m l的 ConA,500μl/孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后,吸出細胞培養(yǎng)上清,12 000 r/min離心15分鐘,取上清液,備用。將生長良好的L929細胞用0.25%胰酶消化液消化,用RPM I1640培養(yǎng)液配制成4×105m l-1,接種于96孔培養(yǎng)板100μl/孔,同時將待測樣品也加入培養(yǎng)板100μl/孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后,輕輕吸去上清液100μl,加入MTT（1 mg/ml）試液100μl,37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時后,2 000 r/min離心5分鐘,吸棄上清液,每孔加DMSO 100μl,作用30分鐘,用酶標測定儀測570 nm處的吸收度。

1.12 IL-2誘生水平的測定 將制備的小鼠脾細胞懸液用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106m l-1,接種于24孔培養(yǎng)板,每孔500μl,每孔再加終濃度為5μg/ml的 ConA,500μl/孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時后,吸出細胞培養(yǎng)上清,12 000 r/min離心15分鐘,取上清,備用。取傳代培養(yǎng)48小時的CTLL-2細胞,用培養(yǎng)液離心洗滌2次,每次1 000 r/min離心5分鐘,再用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105ml-1,接種于96孔培養(yǎng)板100 μl/孔,同時將待測樣品也加入培養(yǎng)板100μl/孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48分鐘后,輕輕吸去上清液100μl,加入MTT（1mg/m l）試液 100μl,37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時后,2 000 r/min離心5分鐘,吸棄上清液,每孔加DMSO 100μl,作用 30分鐘,用酶標測定儀測在570 nm波長處測吸收度。

1.13 對小鼠血清IFN-α生成的影響 酶聯(lián)免疫吸附法測定血清IFN-α的含量,實驗操作按試劑盒說明進行。A 450 nm下,用酶標儀檢測各孔OD值。根據(jù)稀釋標準IFN-αOD值作出標準曲線,用每份標本OD平均值在標準曲線上查出其濃度。

1.14 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件,計量資料用±s表示。用藥組與空白組之間的比較采用單因素方差分析法中的Dunnett-t法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤抑瘤率 實驗顯示癌迪針劑33 mg/kg、55 mg/kg劑量組對何瘤小鼠的腫瘤生長具有一定抑制作用,抑瘤率分別為77.6%、87.2%。與荷瘤對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見圖1,表1。

圖1 癌迪針劑對荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用Fig 1 Effect of AiD i-in jection on the tumor inhibition in tumor bearingm ice

2.2 對荷瘤小鼠免疫器官的影響 從表2可以看出腫瘤模型組小鼠胸腺指數(shù)明顯低于正常組,而三個劑量組能明顯提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù),使其恢復到正常水平,但給藥組并未表現(xiàn)出劑量依賴性。從表2可以看出用藥各劑量組脾臟指數(shù)與荷瘤對照組比較無顯著差異（P＞0.05）,結(jié)果見表2。

2.3 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 從表3可以看出腫瘤模型組小鼠巨噬細胞吞噬功能低于正常組,而三個劑量組能明顯提高荷瘤小鼠的吞噬功能（P＜0.05）,結(jié)果見表3。

2.4 對淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能的影響 腫瘤模型組小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能明顯低于正常組,用CTX治療的小鼠使淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能進一步降低。而藥物組可明顯提高荷瘤小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能,具有劑量依賴性,其中高、中劑量組與正常組比較無明顯差異,結(jié)果見表4。

表1 癌迪針劑對荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用（n=10,±s）Tab.1 Effect of AiDi-injection on the inhibitory rate of tumor of themice（n=10,±s）

表1 癌迪針劑對荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用（n=10,±s）Tab.1 Effect of AiDi-injection on the inhibitory rate of tumor of themice（n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vs NS（tumor bearing group）.

Groups Weight of tumor（mg）Inhibitory rate of tumor（%）NS（tumor bearing） 2 977.3±2 225.75 CTX 1 983.30±1 608.45 33.4 AiDi injection（11mg/kg）1 326.30±1 516.11 50.9 AiDi injection（33mg/kg） 667.88±418.131） 77.6 AiDi injection（55mg/kg） 381.33±275.821） 87.2

表2 癌迪針劑對小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響（n=10,±s）Tab.2 Effect of AiDi-injection on the indexes of thymus and spleen of them ice（n=10,±s）

表2 癌迪針劑對小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響（n=10,±s）Tab.2 Effect of AiDi-injection on the indexes of thymus and spleen of them ice（n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vs NS（tumor bearing group）.

Groups Indexes of spleen Indexesof thymus NS（control） 41.2±4.3 8.3±1.1 NS（tumor bearing） 35.2±3.4 5.8±4.1 CTX 36.2±3.7 7.9±3.5 AiDi injection（11mg/kg） 36.9±2.4 6.2±2.7 AiDi injection（33mg/kg） 37.9±3.1 7.9±1.61）AiDi injection（55mg/kg） 42.6±10.31） 8.2±4.71）

表3 癌迪針劑對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（n=10,±s）Tab.3 Effect of AiDi-in jection on macrophage phagocytosis function of them ice（n=10,±s）

表3 癌迪針劑對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（n=10,±s）Tab.3 Effect of AiDi-in jection on macrophage phagocytosis function of them ice（n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vs NS（tumor bearing group）;2）P＜0.05 vs NS（normal controlgroup）.

Groups Phagocytosis percentage（%）Phagocytosis index NS（control） 60.4±0.4 1.070±0.10 NS（tumor bearing） 30.3±0.52） 0.56±0.082）CTX 50.3±0.51） 0.96±0.18 AiDi injection（11mg/kg） 47.4±1.21） 0.92±0.301）AiDi injection（33mg/kg） 59.3±1.21） 1.00±0.141）AiDi injection（55mg/kg） 59.8±3.21） 1.03±0.181）

2.5 對小鼠TNF活性的影響 給藥組低劑量組能提高荷瘤小鼠TNF活性,但不能達到正常組水平,中、高劑量組能提高到正常組水平,具有劑量依賴性,結(jié)果見表5。

表4 癌迪針劑對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化影響（A450 nm,n=10,±s）Tab.4 Effect of AiDi-injection on lymphocytes transformation function of them ice（A450 nm,n=10,±s）

表4 癌迪針劑對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化影響（A450 nm,n=10,±s）Tab.4 Effect of AiDi-injection on lymphocytes transformation function of them ice（A450 nm,n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vs NS（tumor bearing group）;2）P＜0.05 vs NS（normal control group）.

Groups dpm NS（control） 9 134.4±812 NS（tumor bearing） 5 940±5412）CTX 5 240±8562）AiDi injection（11mg/kg） 10 374.2±5261）AiDi injection（33mg/kg） 12 365.4±2 1481）AiDi injection（55mg/kg） 18 895.2±4 1901）

表5 癌迪針劑對小鼠TNF活性的影響（n=10,±s）Tab.5 Effect of AiDi-injection on TNF activity of them ice（n=10,±s）

表5 癌迪針劑對小鼠TNF活性的影響（n=10,±s）Tab.5 Effect of AiDi-injection on TNF activity of them ice（n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vs NS（tumor bearing group）;2）P＜0.05 vs NS（normal control group）.

Groups TNF（OD）NS（control） 0.24±1.2 NS（tumor bearing） 0.46±1.52）CTX 0.21±1.21）AiDi injection（11mg/kg） 0.33±1.4 AiDi injection（33mg/kg） 0.24±1.31）AiDi injection（55mg/kg） 0.18±1.61）

表6 癌迪針劑對小鼠脾細胞IL-2的影響（n=10,±s）Tab.6 Effect of AiDi-injection on IL-2 of spleen cells of the m ice（n=10,±s）

表6 癌迪針劑對小鼠脾細胞IL-2的影響（n=10,±s）Tab.6 Effect of AiDi-injection on IL-2 of spleen cells of the m ice（n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vsNS（tumor bearing sroup）;2）P＜0.05 vsNS（normal control group）.

Groups IL-2（OD）NS（control） 0.64±5.2 NS（tumor bearing） 0.36±3.12）CTX 0.41±4.7 AiDi injection（11mg/kg） 0.43±2.1 AiDi injection（33mg/kg） 0.54±1.31）AiDi injection（55mg/kg） 0.62±1.61）

表7 癌迪針劑對小鼠IFN-α產(chǎn)生的影響（A450 nm,n=10,±s）Tab.7 Effect of AiDi-in jection on IFN-αof the m ice（A450 nm,n=10,±s）

表7 癌迪針劑對小鼠IFN-α產(chǎn)生的影響（A450 nm,n=10,±s）Tab.7 Effect of AiDi-in jection on IFN-αof the m ice（A450 nm,n=10,±s）

Note:1）P＜0.05 vsNS（tumor bearing groups）;2）P＜0.05 vs NS（normal controlgroup）.

Groups IFN-α（pg/ml）NS（control） 57±2.1 NS（tumor bearing） 44±5.2 CTX 9±2.51）2）AiDi injection（11mg/kg） 98±4.3 AiDi injection（33mg/kg） 118±1.51）2）AiDi injection（55mg/kg） 122±2.11）2）

2.6 對小鼠IL-2（誘生）水平的影響 各劑量組能顯著提高荷瘤小鼠脾細胞IL-2誘生水平,其中高劑量組能提高到正常組的水平,結(jié)果見表6。

2.7 對小鼠血清IFN-α生成的影響 與正常對照組相比,CTX組小鼠血清IFN-α產(chǎn)生顯著降低;與荷瘤相比,癌迪針劑各劑量組IFN-α產(chǎn)生顯著增加,結(jié)果見表7。

3 討論

腫瘤患者常伴有免疫系統(tǒng)機能低下,當腫瘤細胞侵入機體時,會對機體造成免疫功能抑制,許多中藥具有抑制腫瘤生長的作用[5],且毒副作用較低,顯示了較好的抗瘤效果。癌迪針劑為中藥一類新藥,藥效學實驗結(jié)果證明,癌迪針劑對人體外肝癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、HeLa細胞均有明顯的抑制作用[1,2]。本實驗用癌迪針劑對H22荷瘤小鼠進行了體內(nèi)抗腫瘤實驗,結(jié)果顯示癌迪針劑具有明顯的體內(nèi)抗腫瘤作用。實驗表明33mg/kg、55 mg/kg劑量組對H22荷瘤小鼠有明顯抑瘤效果,抑瘤率可達77.6%、87.2%。與荷瘤對照組比較有顯著性差異。同時我們的實驗結(jié)果表明,癌迪針劑能明顯提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù),使其恢復到正常水平,但給藥組并未表現(xiàn)出劑量依賴性。另外癌迪針劑可明顯提高荷瘤小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能,具有劑量依賴性。巨噬細胞是機體抗腫瘤免疫作用中的重要效應細胞。巨噬細胞的抗腫瘤作用具有選擇性,即僅殺傷腫瘤細胞而不殺傷正常細胞,本實驗癌迪針劑明顯提高荷瘤小鼠巨噬細胞的吞噬功能。另外,激活的巨噬細胞在殺傷腫瘤細胞同時會釋放IFN-α,而Ⅰ型干擾素的主要生物學作用是抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。而從本實驗可見癌迪針劑組可促進IFN-α產(chǎn)生。

TNF是由單核-巨噬細胞系統(tǒng)分泌的一種細胞因子,具有多種生物學活性。如能夠激活T細胞、刺激B細胞產(chǎn)生抗體、刺激單核細胞等產(chǎn)生細胞因子、促進白細胞殺死微生物及殺滅腫瘤細胞等功能。其最大特點是能選擇性殺傷腫瘤細胞,抑制腫瘤細胞增殖,而不影響正常細胞的生長、分化和代謝功能。本實驗結(jié)果表明,腫瘤模型組的TNF活性較正常組明顯下降,而三個劑量組TNF活性與腫瘤模型組比較具有很大的提高,與正常組比較無差異。

IL-2是由活化的輔助性T細胞分泌的一種細胞增殖因子,具有多種生物學活性。如能夠促進T細胞增殖及維持T細胞體外長期生長、促進B細胞增殖分化和刺激NK細胞生長,在機體的免疫應答和調(diào)節(jié)中起重要作用。另有學者表明,IL-2能促進外周血單核細胞產(chǎn)生TNF,從而增強抗腫瘤的作用[6]。由于IL-2的含量與機體的免疫功能相關,尤其是與細胞免疫功能密切相關,因此可將IL-2的產(chǎn)生作為細胞免疫效應的主要指標。本實驗結(jié)果表明,腫瘤模型組脾細胞的IL-2誘生水平明顯低于正常組,這與國內(nèi)外學者的研究結(jié)果相一致,而三個劑量組的IL-2誘生水平與腫瘤模型組比較可以明顯提高,且隨劑量增加而增加,直至達到正常組的水平。說明癌迪針劑可改善荷瘤小鼠的免疫指標,提高機體的抗腫瘤能力,并能改善荷瘤小鼠的免疫失衡狀態(tài)[7]。癌迪針劑可通過增強機體的細胞免疫和活化免疫細胞分泌細胞因子參與抗腫瘤作用,達到殺滅腫瘤細胞的目的。

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2 艾金霞,劉 良.SBHL對人宮頸癌細胞凋亡作用的實驗研究[J].北華大學學報,2008;1（6）:221-223.

3 徐叔云,卞如濂.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:944-952.

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7 Graves D T,cochran D.The contribution of interleukin-1 and tumor necrosis factor toperiodontal tissue destruction[J].Jperiodontol,2003,74（3）:391-392.

[收稿2009-11-20 修回2009-12-23]

（編輯 倪 鵬）

The effect of AD injection on immune functions in tumor-bearingmice

AIJin-Xia,LIULiang.DepartmentofImmunology,MedicalCollegeofBeihuaUniversity,Jilin132013,China

Objective:In order to study the antitumoreffectof AD injection and itsimmunologicalmechanisms.Methods:Liver cancer H22-bearingmice were treatedwith AD injection and 7 days later toobserve the effectofAD injectionon the inhibitory rateof tumor,indexesof thymus and spleen,lymphocytes transformation function,phagocytosis of the peritonealmacrophage,activity of TNF,the levelof IL-2 and IFN-α in serum.Results:AD in jection could inhibit the grow th of tumor in bearingmice significantly and promote the transformation function of lymphocytes and enhance the peritonealmacrophage phagocytosis and the activities of TNF.AD injection could improve the levelof IL-2 of spleen cells and IFN-αin serum.Conclusion:These results suggested that AD in jection could obviously inhibit the growth of tumor and enhance the immune functions in bearingmice.

AD-injection;Antitumor;Immunological function

R392.1

A

1000-484X（2010）03-0224-04

①本文為吉林市卓怡康納中藥研發(fā)基金（ZY040301）

②北華大學生物與化學學院,吉林132013

艾金霞（1968年-）,女,碩士,副教授,E-mail:bhdxajx@163.com。

·腫瘤免疫學·