利用小鼠感染模型篩選與鑒定幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白抗原①

陶好霞 王 袁盛凌 展德文 王令春 王艷春 劉純杰

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所,北京 100071）

利用小鼠感染模型篩選與鑒定幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白抗原①

陶好霞②王②袁盛凌 展德文 王令春 王艷春 劉純杰③

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所,北京 100071）

目的:利用小鼠感染模型篩選與鑒定幽門(mén)螺桿菌SS1株的外膜蛋白抗原。方法:提取SS1株的外膜蛋白進(jìn)行雙向電泳,用幽門(mén)螺桿菌感染的小鼠血清作免疫印跡實(shí)驗(yàn),將陽(yáng)性反應(yīng)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析,將肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)輸入互聯(lián)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。結(jié)果:獲得32種抗原相關(guān)蛋白。通過(guò)與已有報(bào)道的幽門(mén)螺桿菌感染人抗原比較分析,發(fā)現(xiàn)大部分典型的保護(hù)性抗原在本實(shí)驗(yàn)中都可以檢測(cè)到。結(jié)論:幽門(mén)螺桿菌感染的小鼠模型適用于人用保護(hù)性幽門(mén)螺桿菌抗原的篩選;而且此研究中得到的相關(guān)抗原蛋白對(duì)于尋找與鑒定幽門(mén)螺桿菌未知保護(hù)性抗原也有參考價(jià)值。

幽門(mén)螺桿菌;動(dòng)物模型;雙向電泳;免疫方法;抗原篩選

幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori,Hp）是一種革蘭氏陰性微需氧菌,寄生于人胃粘膜表面的粘液層。目前全世界一半以上的人感染Hp,而且最終有近1%～2%的感染者會(huì)發(fā)展為胃癌[1]。Hp感染的藥物治療可以采用抗生素、質(zhì)子泵抑制劑和鉍劑聯(lián)合用藥來(lái)進(jìn)行,但這些藥物的有效率只有80%～90%,并且對(duì)細(xì)菌清除后并不能防止Hp的再次感染,而現(xiàn)在面臨的最大問(wèn)題就是Hp耐藥株的出現(xiàn)[2]?？紤]到目前全球感染Hp需要治療的人數(shù)大大超過(guò)了三聯(lián)抗生素用藥可以治療的人數(shù),因此研制出Hp疫苗成為控制Hp全球感染的唯一可行的途徑。已經(jīng)證明的具有免疫保護(hù)作用的Hp抗原包括尿素酶（UreA和UreB）、VacA、CagA、過(guò)氧化氫酶（KatA）、分子伴侶GroES和GroEL[3-6]。但還沒(méi)有一種抗原可以在人體中實(shí)現(xiàn)100%的保護(hù)作用,在動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)表明多個(gè)抗原的聯(lián)合應(yīng)用可以提高免疫保護(hù)效果。為了得到具有高效保護(hù)作用的Hp疫苗,首要任務(wù)是在Hp的蛋白質(zhì)組中找到可以引發(fā)較強(qiáng)免疫反應(yīng)的保護(hù)性抗原。Hp定植于胃粘膜層和胃上皮細(xì)胞的頂端,因此它的位于細(xì)菌外膜的蛋白和分泌性蛋白更易于激發(fā)宿主的CD4+T細(xì)胞反應(yīng),而且大部分已知的Hp保護(hù)性抗原都是位于外膜或是分泌性的[7]。

大多數(shù)的Hp疫苗臨床前研究都用小鼠作為感染治療模型。小鼠并不是Hp的天然宿主,但有一些Hp的菌株經(jīng)過(guò)幾代馴化后可以定植于小鼠的胃中,如本實(shí)驗(yàn)中用到的HpSS1株。在小鼠模型中有一些研究的疫苗能夠在Hp攻毒時(shí)產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果,但用于臨床受試者時(shí)效果卻不十分理想。為了了解Hp的外膜蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況,從而對(duì)小鼠模型用于Hp人類(lèi)疫苗研究的可行性作出評(píng)價(jià),我們采用了蛋白質(zhì)組學(xué)的方法將Hp的外膜蛋白進(jìn)行雙向電泳,然后用Hp感染的小鼠血清對(duì)得到的雙向分離蛋白點(diǎn)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),對(duì)得到免疫反應(yīng)蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析,與已有報(bào)道的Hp感染病人的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比較分析,從而對(duì)小鼠模型在用于Hp感染人類(lèi)的保護(hù)性抗原的篩選的可行性上進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 幽門(mén)螺桿菌HpSS1（Sydney strain1）由廣州中山醫(yī)科大學(xué)陳湖教授惠贈(zèng)。免疫用Hp小鼠血清通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行活菌口服灌胃獲得。

1.2HpSS1外膜蛋白的制備及含量測(cè)定[8]采用空腸彎曲菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（其中含10μg/ml鹽酸萬(wàn)古霉素,2.5μg/ml多粘菌素B,2μg/m l兩性霉素B及7.5%脫纖維羊血）,復(fù)蘇和擴(kuò)增SS1菌種,用20 mmol/LTris·Cl（pH7.4）溶液收集和洗滌菌體2次,菌體沉淀用20mmol/LTris·Cl（pH 7.4）溶液懸浮,冰浴超聲之后加入RNA酶和DNA酶室溫消化核酸,離心棄去沉淀,將上清于4℃離心1小時(shí)。沉淀中加入10ml 20mmol/L Tris·Cl（pH7.4）和 2%十二烷基肌氨酸鈉（SKL）,于4℃離心1小時(shí)。沉淀中加入30m l純水懸浮,離心,收集沉淀,用300μl純水徹底溶解,用2-D Quanti-kit試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量分裝,1mg/支。直接上樣或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 雙向電泳 參照操作手冊(cè)[9],并根據(jù)G?rg等[10,11]的文獻(xiàn)進(jìn)行了一些改進(jìn)。

具體方法是:取兩份外膜蛋白各400μl（1mg）加入IPG緩沖液和水化液至總體積為350μl,然后于室溫振蕩30分鐘,使溶解徹底。4℃離心輕取上清,加于IPG phor電泳槽中,輕覆以 IPG干膠條（pH3-10）,按照如下條件于17℃進(jìn)行等電聚焦:水化0 V,6小時(shí);30V,6小時(shí);500 V,1小時(shí);1 000 V,1小時(shí);8 000 V,24小時(shí)。當(dāng)電壓時(shí)間積達(dá)到4-6萬(wàn)Vhrs時(shí)終止等電聚焦程序。第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）:在Bio-Rad ProteanⅡXi垂直電泳儀上進(jìn)行。將兩個(gè)膠條依次用100 mg DTT加入10 ml平衡緩沖液和450mg碘乙酰胺加入10m l平衡緩沖液中進(jìn)行平衡,再將兩個(gè)膠條同時(shí)轉(zhuǎn)入兩塊12.5%SDS-PAGE膠面上端進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。其中一塊SDS-PAGE膠用考馬斯亮蘭G-250染色,再用ImageScanner進(jìn)行掃描,所用掃描軟件為L(zhǎng)abScan;考染凝膠掃描后用保鮮膜包裹,4℃保存以便取點(diǎn)時(shí)使用。圖像分析用ImageMaster 2D Elite 3.1和ImageMaster 2D Elite Platnum進(jìn)行。蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子量根據(jù)同步電泳的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的位置計(jì)算,等電點(diǎn)直接按所用IEF膠條的pH范圍計(jì)算,并通過(guò)軟件獲取每個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度值。

1.4 Western blot 將平行操作的另一塊SDS-PAGE膠電轉(zhuǎn)1小時(shí)至硝酸纖維素膜。然后用麗春紅室溫染色10分鐘,純水沖洗脫色至清晰,掃描圖像。加入5%脫脂奶粉于4℃封閉過(guò)夜,加入用SS1免疫的小鼠血清,37℃輕搖1小時(shí),用TBST洗膜3次后,加入用5%脫脂奶粉稀釋的二抗,37℃輕搖1小時(shí),用TBST洗膜3次后,進(jìn)行ECL顯色。

1.5 膠內(nèi)酶切、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[12]將與Western blot中起反應(yīng)的免疫反應(yīng)蛋白點(diǎn)對(duì)應(yīng)于SDS-PAGE膠上的點(diǎn)切下,放入50μl脫色液中脫色,真空離心干燥,再分別用 5%三氟乙酸、2.5%三氟乙酸/50%乙腈和100%乙腈抽提,真空離心干燥,用0.5%三氟乙酸充分溶解沉淀,用于質(zhì)譜分析。將a-氰基-4-羥基肉桂酸（a-CCA）溶于含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液中,制成飽和溶液,離心,取1μl上清與1μl肽段提取液等體積混合,取1μl點(diǎn)在Scorce384靶上,送入離子源中進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè):反射檢測(cè)方式;飛行管長(zhǎng) 3m;氮激光器:波長(zhǎng)337 nm;加速電壓20 kV;反射電壓為23 kV。登陸http://www.matrixscience.com,用 Mascot程序?qū)ALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)得到的肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行檢索。數(shù)據(jù)庫(kù)選NCBInr或MSDB,種屬選Proteobacteria。氨基酸固定修飾方式一般選擇Carbam idomethyl（C）修飾（或選擇為可能修飾）、可能的修飾方式選Oxidation（M）修飾。檢索時(shí)選取單同位素峰,一個(gè)誤切,可接受的肽段分子量誤差一般設(shè)為0.3 Da。為使鑒定結(jié)果更可靠,一般情況下要求至少有5個(gè)肽匹配,在蛋白質(zhì)整個(gè)序列的覆蓋率至少15%,但對(duì)于小于20 kD的蛋白質(zhì),則要求至少3個(gè)肽匹配和20%的覆蓋率。

1.6 蛋白質(zhì)表達(dá)情況的分析 根據(jù)基因組注釋?zhuān)╳ww.tigr.org）所預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)和分子量與電泳凝膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同區(qū)段的分布,分析雙向電泳參考圖譜的覆蓋情況;根據(jù)所鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)在凝膠中的等電點(diǎn)、分子量值與預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)、分子量作圖,分析二者之間的符合情況及可能的翻譯后修飾情況;根據(jù)基因組注釋所提供的蛋白質(zhì)功能分類(lèi)及定位情況,統(tǒng)計(jì)所鑒定的蛋白質(zhì)在不同的功能分類(lèi)及細(xì)胞內(nèi)定位中的分布和覆蓋情況。

2 結(jié)果

2.1Hp外膜蛋白雙向電泳圖譜的建立 使用pH值為3～10的IPG干膠條,通過(guò)3次相對(duì)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)提取Hp的外膜蛋白進(jìn)行電泳,得到重復(fù)性較好的Hp外膜蛋白雙向電泳圖譜（圖1）。

2.2 免疫蛋白點(diǎn)的篩選和鑒定 先用麗春紅進(jìn)行可逆染色對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位,然后將自制的用HpSS1株全菌灌胃提取的小鼠血清進(jìn)行Western blot（圖2）;從考馬斯亮蘭染色凝膠上找出顯色的點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn),切取該點(diǎn)經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶切后,使用MALDI-TOF質(zhì)譜成功鑒定了32個(gè)免疫反應(yīng)蛋白點(diǎn)（表1）。這些蛋白點(diǎn)可以歸為以下幾類(lèi):與細(xì)胞泳動(dòng)相關(guān)的蛋白（T1、T7、T8、T30）;細(xì)胞加工蛋白（T3、T4、T9）;酶類(lèi)（T5、T11、T16、T17、T19、T20、T22、T25、T26、T29、T32）;翻譯相關(guān)蛋白（T2、T6、T12、T13、T24）;假想 蛋白（T15、T23、T27、T31）;調(diào)控 蛋白（T21）;金屬螯合相關(guān)蛋白（T28）;細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白（T10）;胞壁合成相關(guān)蛋白（T18、T14）。

2.3 免疫結(jié)合蛋白與人血清鑒定到的抗原的比較將鑒定到的32個(gè)蛋白的全稱(chēng),或者蛋白TIGR號(hào)（如HP0072）作為搜索關(guān)鍵詞,在網(wǎng)站PubMed（www.pubmed.com,www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,經(jīng)過(guò)比較分析共有17種作為抗原在Hp感染的人類(lèi)血清中也可以檢測(cè)到。將這些抗原的名稱(chēng),在細(xì)胞中的位置及與人血清反應(yīng)的特異性列于表2中。

表1 質(zhì)譜鑒定的免疫反應(yīng)蛋白點(diǎn)Tab.1 Identification of immunogenic H.pylori p roteins by Immuno blotand M S

圖1 Hp SS1外膜蛋白雙向電泳圖Fig.1 2D map（pH 3 to10）of outer membrane proteins of Hp SS1

圖2 Hp SS1胞外膜蛋白的小鼠血清W estern blotFig.2 W estern blot of a 2D gel hybridized with serum from murinemodel

3 討論

雙向電泳的一塊PAGE膠上可以分辨100×100個(gè)點(diǎn),結(jié)合Western blot方法可以大大提高抗原蛋白的檢出率,因此免疫蛋白質(zhì)組學(xué)是尋找抗原的良好技術(shù)平臺(tái)。本研究運(yùn)用該技術(shù)體系,在HpSS1株的外膜蛋白中成功鑒定了32個(gè)與小鼠血清進(jìn)行免疫反應(yīng)的蛋白點(diǎn)。

細(xì)菌的泳動(dòng)和趨化能力與它的毒力密切相關(guān)。本研究鑒定出了與Hp鞭毛合成和細(xì)菌趨化作用相關(guān)的有4個(gè)蛋白:FlgE（HP0870）、FlaA（HP0601）、FlaB（HP0115）和CheW（HP0391）。FlaA和FlaB是位于細(xì)胞外的鞭絲的組成亞基。FlaA和FlaB是研究較多的Hp鞭毛抗原,它們可以在宿主體內(nèi)引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[13,14]。FlgE位于外膜,它組成了細(xì)菌鞭毛鞭絲與基體動(dòng)力裝置相連接的彈性結(jié)構(gòu),flgE基因的缺失會(huì)導(dǎo)致鞭毛鉤體無(wú)法形成,進(jìn)而使細(xì)菌喪失泳動(dòng)能力。CheW是假想嘌呤結(jié)合的趨化蛋白,它可以將趨化因子的受體信號(hào)跨膜傳送到鞭毛的動(dòng)力系統(tǒng)[15]。cheW基因缺失的Hp的趨化能力喪失,并且在小鼠胃內(nèi)引發(fā)的炎癥反應(yīng)減弱[16]。

表2 小鼠血清中檢測(cè)到的幽門(mén)螺桿菌抗原的相關(guān)特性Tab.2 Characteristic of Helicobacter pylori antigen from murinemodle

在Hp中,熱休克蛋白（HSP）可以介導(dǎo)關(guān)鍵蛋白的分泌和折疊,使蛋白活性部位不會(huì)暴露于酸性環(huán)境中,從而對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用。共鑒定到了3個(gè)具有免疫原性的屬于HSP家族的蛋白:DnaK（hsp70,HP0109）、HtpG（hsp90,HP0210）和 GroEL（hsp60,HP0010）。GroEL在調(diào)控尿素酶活性上起到一定作用[17],DnaK還可以起到粘附素的作用[18],對(duì)抗不利的外界環(huán)境介導(dǎo)Hp定植于胃粘膜。DnaK和GroEL都可以引發(fā)機(jī)體胃表皮慢性炎癥的發(fā)生,它們都可以作為Hp的備選保護(hù)性抗原[19]。

鑒定的蛋白中很多具有酶活性,大致可以把它們分為五類(lèi):（1）毒力相關(guān)酶類(lèi)。尿素酶是Hp的重要毒力蛋白,它能夠中和胃酸,對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用。尿素酶由UreA和UreB兩個(gè)亞單位組成,它們均為Hp保護(hù)性抗原,在實(shí)驗(yàn)中也鑒定到了這兩種蛋白。而蛋白HypB（HP0900）是作為鎳特異性的金屬分子伴侶起作用的,它參與鎳離子的固定和將鎳離子轉(zhuǎn)移至尿素酶的金屬結(jié)合區(qū)[20]。（2）物質(zhì)代謝相關(guān)酶類(lèi)。其中磷酸甘油酸脫氫酶（SerA,HP0397）是細(xì)菌甘油代謝的重要酶。草酰琥珀酸脫羧酶（HP0027）參與了細(xì)菌的三羧酸循環(huán)。桂醇脫氫酶（CAD,HP1104）催化p-羥基桂醇類(lèi)物質(zhì)向其相應(yīng)醇類(lèi)物質(zhì)的可逆轉(zhuǎn)換,HP1104編碼的CAD還具有歧化酶活性,它可以催化苯甲醛為苯甲醇或苯甲酸,從而降低細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的醛類(lèi)物質(zhì)的濃度,利于細(xì)菌在氧應(yīng)激條件下生存,在酸刺激條件下,Hp的CAD產(chǎn)物上升了24倍[21,22];并且有研究者在胃癌患者的血清中檢測(cè)到了HpCAD的抗體[23]。（3）氧化還原作用酶類(lèi)。Hp在宿主胃粘膜上生存必然要應(yīng)對(duì)外界環(huán)境中物理、化學(xué)或生物因素的刺激,應(yīng)對(duì)于此,細(xì)菌自身具有氧化還原功能的酶類(lèi)的分泌會(huì)提高,從而對(duì)有殺傷細(xì)菌作用的蛋白分子產(chǎn)生還原作用,保護(hù)細(xì)菌免受傷害。本實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)酶包括硫氧化還原蛋白還原酶（TrxB,HP0825）,它能夠特異還原胰島素、粘液素、IgG和IgA內(nèi)部的二硫鍵,另外研究證實(shí)TrxB能夠幫助Hp通過(guò)接觸性還原反應(yīng)將胃粘膜層中連接粘蛋白單體之間的半胱氨酸連接區(qū)的二硫鍵打破,從而使Hp通過(guò)難以穿越的胃粘液層在胃粘膜層得以定植[24]。還有Mda66,它是一種NADPH醌還原酶蛋白,能夠?qū)Ⅴ€原為苯二酚,細(xì)胞內(nèi)的醌代謝對(duì)于細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境的氧化應(yīng)激反應(yīng)有著直接的影響,因此Mda66的還原形態(tài)在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。有報(bào)道稱(chēng)mda66的基因突變株對(duì)于氧化應(yīng)激反應(yīng)敏感并且能夠降低在鼠胃部中的定植能力[25]。除此之外,我們還鑒定到的具有氧化還原作用的酶包括鐵氧化還原蛋白氧化還原酶的β亞基（HP0590）和細(xì)胞色素c氧化還原酶（HP1504）,它們都是細(xì)菌呼吸鏈的重要成分。（4）蛋白酶類(lèi)。HP1019為假想的絲氨酸蛋白酶和分子伴侶H trA,實(shí)驗(yàn)證明HtrA是一種具有蛋白水解活性的分泌酶,作為一種功能蛋白它既存在于細(xì)胞周質(zhì)中起熱應(yīng)激降解作用,也存在于胞外基質(zhì)中起毒力因子的作用[26]。

我們還鑒定了與蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的5種蛋白,它們是延伸因子 EF-G（FusA,HP1195）、EF-Tu（HP1205）、脯氨酸 tRNA合成酶（ProS,HP0238）、絲氨酸t(yī)RNA合成酶（SerS,HP1480）、DNA介導(dǎo)的RNA聚合酶α亞基（RpoA,HP1293）。其中EF-G、EF-Tu和RpoA都可以作為抗原蛋白與感染Hp病人的血清進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)[19,27]。在我們鑒定到的蛋白中,有四種為假想蛋白,它們分別是假想的ATP結(jié)合保守蛋白（HP1507）、假想的脂多糖合成蛋白（Jhp0147）、假想的功能不明蛋白（HP0231）、假想的巰基過(guò)氧化物酶Tpx（HP0390）。其中Jhp0147編碼的酶證明具有葡萄糖轉(zhuǎn)移酶功能,與α-1,6-葡聚糖聚合體的合成有關(guān),該聚合體是細(xì)菌核心LPS的一部分[28]。HP0231是近年來(lái)研究的比較多的一個(gè)蛋白,實(shí)驗(yàn)證明它是一種保護(hù)性抗原,用重組表達(dá)的HP0231免疫小鼠然后用Hp攻毒,其保護(hù)效果接近Hp免疫實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)的4倍劑量[29]。Tpx蛋白體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜻€原H2O2,Hp的tpx突變株比野生株更易被過(guò)氧化物和超氧化物殺死,并且tpx突變株在小鼠胃內(nèi)的定植能力降低[30]。

本實(shí)驗(yàn)中我們鑒定到了二元調(diào)控系統(tǒng)HP1364/HP1365中的調(diào)控蛋白HP1365,該二元系統(tǒng)對(duì)于銅誘導(dǎo)的CrdA的轉(zhuǎn)錄和Hp對(duì)于銅離子的抗性是必須的,而且在小鼠模型中證明它們對(duì)于Hp在胃中的定植是必須的[31]。鑒定到的另一種與銅離子代謝有關(guān)的蛋白稱(chēng)為銅離子輔助合成蛋白C（MoaC,HP0798）,它參與銅離子的攝取。鑒定到的蛋白還有與細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白FtsA（HP0978）,以及與胞壁合成相關(guān)的蛋白,這包括M reB（HP1373）,它編碼假想的盤(pán)尼西林結(jié)合蛋白1A,并且參與細(xì)胞壁的合成[32];以及天冬氨酸半醛脫氫酶（Asd,HP1189）,它是細(xì)菌DAP合成途徑的關(guān)鍵酶,而DAP是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。

經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)比對(duì),本研究鑒定到的蛋白中有17種蛋白與已有報(bào)道的與人血清有抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的Hp蛋白相一致。而其中之所以存在有胞內(nèi)蛋白,是因?yàn)镠p具有自發(fā)裂解的特性,會(huì)使一些胞內(nèi)蛋白釋放到胞外,從而使該蛋白也具有抗原性[35]。

本研究通過(guò)將HpSS1菌株的外膜蛋白中與細(xì)菌感染的小鼠血清呈陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白用雙向電泳和免疫印跡的方法進(jìn)行總體的篩選和鑒定,得到蛋白點(diǎn)經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)很大一部分都與Hp的毒力和在宿主內(nèi)的定植能力密切相關(guān),再把得到的蛋白與已有報(bào)道的與Hp感染的人血清反應(yīng)陽(yáng)性抗原進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者具有較高的相似性,說(shuō)明小鼠感染的模型適于臨床應(yīng)用前的Hp抗原候選蛋白的篩選,而且本實(shí)驗(yàn)中所得到的一些蛋白點(diǎn)于未知的Hp的保護(hù)性抗原的選擇也有借鑒意義。

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[收稿2009-11-20]

（編輯 許四平）

Antigen screening and identification of Helicobacter pyloriouter membrane proteins from murine infection model

TAOHao-Xia,WANGPeng,YUANSheng-Ling,ZHANDe-Wen,WANGLing-Chun,WANGYan-Chun,LIUChun-Jie.BeijingInstituteofBiotechnology,InstituteofBiotechnology,MilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China

Objective:To screen antigen of Helicobacter pylorioutermembrane proteins bymurine infectionmodel.Methods:Parallel two-dimensional gel electrophoresis（2D）of outermembrane p roteins extracted from Helicobacter pyloristrain SS1 was performed.Western blot of a duplicate2D gelhybridized with serum fromH.pylori-infectedmurinewas employed.ImmunogenicH.pyloriproteins identified in this way were digested ingel by trypsin and themass of generated peptidesweremeasured bymatrix assisted laser desorption ionization timeof flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）.The data obtained from peptidemass finger-printing（PMF）were searched using the internet availab le database.Results:32 proteinswere identified and they are in good agreementwith typical protectiveantigenswhich reacted with serum fromH.pylori-infected patients.Conclusion:The results suggest thatmurinemodel ofH.pylorimay be valid to screen antigens forhuman vaccination and the proteins identified in this paper are valuable for the selection ofH.pyloriprotective antigens aswell.

Helicobacterpylori;Animal diseasemodel;Two-dimensional gel electrophoresis;Immunology;Antigen screening

R391.2

A

1000-484X（2010）03-0195-06

①本文為“十一五”國(guó)家863重大項(xiàng)目（2006AA 02A219）

②共同并列第一作者

③通訊作者,E-mail:liucj@nic.bm i.ac.cn

陶好霞（1968年-）,女,實(shí)驗(yàn)師;王 （1976 年 -）,女,博士,助理研究員。