乳酸對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷后適應(yīng)的心肌保護作用＊

張國明,王禹,李天德,張大為,劉秀華,李玉珍

乳酸對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷后適應(yīng)的心肌保護作用＊

張國明,王禹,李天德,張大為,劉秀華,李玉珍＊

目的：在大鼠急性心肌缺血再灌注中,探討乳酸延長局部組織酸中毒能否模擬后適應(yīng)發(fā)揮有效的心肌保護作用。

方法：72只 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、再灌注損傷組、后適應(yīng)組和乳酸組,每組 18只。測定再灌注 10min后右心房血漿pH值,并在不同時間點處死大鼠,分別測定心肌酶活力、心肌丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、心肌組織線粒體吸光度,磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶、線粒體調(diào)控因子Bcl-2和 Bax的表達,以及細胞凋亡和心肌梗死面積。

結(jié)果：再灌注 10min后乳酸組與后適應(yīng)組右心房血漿pH值相似(P＞0.05)。再灌注 1h后乳酸組和后適應(yīng)組同再灌注損傷組相比均顯著抑制了線粒體吸光度的降低(P＜0.05),但再灌注 6 h后乳酸組抑制作用明顯減弱(P＞0.05)。乳酸組和再灌注損傷組相比未改變心肌組織丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性(P＞0.05)。磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶、Bcl-2和Bax的表達上乳酸組雖優(yōu)于再灌注損傷組(P＜0.05),但同后適應(yīng)組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。另乳酸組可不同程度降低心肌酶活力、凋亡指數(shù)和心肌梗死面積,但凋亡指數(shù)仍顯著高于后適應(yīng)組(P＜0.05)。

結(jié)論：乳酸可以部分模擬后適應(yīng)帶來的保護效應(yīng),局部酸中毒的短暫延長可能只是后適應(yīng)最上游觸發(fā)因子之一。關(guān)鍵詞 后適應(yīng);再灌注損傷;乳酸;酸中毒;線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

(Chinese Circulation Journal,2010,25：34.)

迅速有效再灌注治療是應(yīng)對急性心肌缺血的最佳方法,但可帶來再灌注損傷。2003年 Zhao等[1]提出了缺血后適應(yīng)的概念,多項研究證實后適應(yīng)可有效減輕再灌注損傷[2-4],研究認為后適應(yīng)的保護機制最后都歸于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的抑制[5,6]。Cohen等[7]提出了后適應(yīng)觸發(fā)因子的酸中毒假說,認為碳酸緩沖液可模擬后適應(yīng)的保護作用。本研究在活體大鼠心肌梗死再灌注模型中,使用乳酸延長局部組織酸中毒模擬后適應(yīng),以進一步探討后適應(yīng)保護機制的上游觸發(fā)因子。

1 材料與方法

材料：健康雄性 SPF級 SD大鼠 72只,于 2008-07至 2008-11購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,體重200～250 g。乳酸購自北京化學(xué)試劑公司,微量丙二醛和超氧化物歧化酶試劑盒購自南京建成科技有限公司,心肌組織線粒體提取試劑盒和通透性轉(zhuǎn)換孔比色法檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。兔抗小鼠磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶、線粒體調(diào)控因子Bcl-2和 Bax多克隆抗體購自美國 SantaCruz公司,凋亡試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

模型制作：按趙秀梅等[8]的球囊墊扎法復(fù)制大鼠在體心肌梗死再灌注模型。以 2%戊巴比妥鈉(0.23ml/100 g)腹腔注射麻醉,呼吸機輔助呼吸,開胸后在左心耳下緣與肺動脈圓錐間用縫合線穿過前降支深部,將充盈的后擴張球囊[Acrostak公司,瑞士,壓力調(diào)為 1大氣壓(ATM)]墊于血管與結(jié)扎線之間,結(jié)扎后將壓力調(diào)節(jié)為 12 ATM。缺血 45分鐘后將壓力迅速調(diào)為 0 ATM,根據(jù)分組給予不同處理。術(shù)后 24小時(每組 6只),以20%烏拉坦(0.8ml/100 g)腹腔注射麻醉,經(jīng)右頸總動脈插管入左心室,監(jiān)測主動脈及左心室壓力,而后經(jīng)頸動脈插管取血 3～4m l,處死取心臟(另術(shù)后 1小時和術(shù)后 6小時每組各取6只大鼠,麻醉后直接處死取心臟)。

實驗分組：隨機分為 4組(每組 18只)：假手術(shù)組：分離左冠狀動脈并穿線,但不結(jié)扎,曠置 45min后微量注射器(100μl)注射生理鹽水 60μl;再灌注損傷組：缺血 45min后將壓力調(diào)至 0 ATM,移除球囊后立即微量注射器在缺血部位分三點注射生理鹽水共計60μl,而后持續(xù)再灌注;后適應(yīng)組：缺血 45 min后、再灌注前通過球囊放氣—充盈實現(xiàn)再灌注和缺血反復(fù) 4輪,其時間為 20/20 s×4,移除球囊后立即微量注射器在缺血部位分三點注射生理鹽水共計 60μl,而后持續(xù)再灌注;乳酸組：缺血 45min移除球囊后,立即使用微量注射器在缺血部位分三點注射乳酸共計 60μl,而后持續(xù)再灌注。

缺血心肌丙二醛和超氧化物歧化酶活性測定：使用術(shù)后 1 h處死大鼠,檢測方法按試劑盒說明書進行。缺血心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔測定：使用術(shù)后 1 h和6 h處死大鼠,取出心臟后迅速冷凍,2周內(nèi)進行檢測。首先差速離心法提取線粒體(低溫離心機 1000 g 10分鐘,取上清低溫高速離心機 10000 g 15分鐘,沉淀物為線粒體),詹納斯綠 B對線粒體進行鑒定;蛋白定量后取線粒體(每組含蛋白 200μg)按試劑盒說明書稀釋、誘導(dǎo),使用酶標儀在 520 nm測定線粒體吸光度,取0min、1min、5min、15min、30 min五個時間點檢測。蛋白免疫印跡分析：使用術(shù)后 6 h處死大鼠,取出心臟迅速冷凍,2月內(nèi)進行檢測,勻漿后行聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、兩次免疫反應(yīng),抗原抗體復(fù)合物用化學(xué)發(fā)光法顯示,以 Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的積分光密度值(平均光密度值 ×面積)。心肌酶活力測定：經(jīng)動脈插管抽取動脈血后,3000 rpm離心 15min后取上清,冷凍保存,而后以全自動生化分析儀(日本日立公司)測定肌酸激酶和肌酸激酶同工酶活性。凋亡檢測：使用術(shù)后 24 h處死大鼠,取心臟中性甲醛固定 24 h(10%,pH=7.4),按試劑盒說明行心肌組織切片細胞凋亡的原位檢測。每張切片隨機取5個高倍視野,計算出平均每 100個細胞中的凋亡細胞數(shù),以百分數(shù)表示凋亡指數(shù)。心肌梗死面積測定：再灌注 24 h經(jīng)頸動脈取血后,將頸動脈插管回抽至主動脈,開胸將原結(jié)扎絲線再次結(jié)扎,經(jīng)頸動脈插管緩慢注入 1%伊文氏藍 3～5m l。染色冷凍后按垂直于左心室長軸方向切片,置入 2%三苯基氯化四氮唑孵育20 min。掃描后采用 Image-Pro Plus圖像分析軟件分別計算各部分的面積。缺血心肌用缺血心肌面積與左心室面積之比表示,梗死范圍以梗死心肌面積與缺血心肌面積之比表示。

2 結(jié)果

血流動力學(xué)：再灌注 24 h后 3組間心率和平均動脈壓未見明顯差異,后適應(yīng)組和乳酸組與再灌注損傷組比較壓力最大上升速度和壓力最大下降速度明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);乳酸組與后適應(yīng)組相比壓力最大上升速度顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 (表 1)

表 1 3組再灌注 24 h后的血流動力學(xué)比較(n=6,±s)

表 1 3組再灌注 24 h后的血流動力學(xué)比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05;1mmHg=0.133 kPa。

組別 心率(次/分) 平均動脈壓(mmHg)壓力最大上升速度(mmHg/s)壓力最大下降速度(mmHg/s)再灌注損傷組 351.00±36.18 98.17±10.23 604.83±60.72 441.00±37.79后適應(yīng)組 376.50±45.33 105.33±5.39 781.67±59.72＊ 546.67±57.79＊乳酸組 357.33±33.67 99.83±5.31 686.67±61.09＊△ 522.17±44.41＊

右心房血漿 pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比較：再灌注 10 min后右心房血漿 pH值、肌酸激酶及肌酸激酮同工酶乳酸組和后適應(yīng)組之間沒有明顯差異,但這兩組均較再灌注損傷組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。丙二醛含量后適應(yīng)組低于再灌注損傷組,超氧化物歧化酶活性后適應(yīng)組高于再灌注損傷組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而乳酸組這兩項指標雖較再灌注損傷組好轉(zhuǎn),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),乳酸組同后適應(yīng)組之間這兩項指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(表 2)

表 2 3組再灌注 10m in后右心房血漿pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比較(±s)

表 2 3組再灌注 10m in后右心房血漿pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比較(±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05

組別 右心房血漿 pH值(n=18)丙二醛含量(nmol/mgpro,n=6)超氧化物歧化酶活性(U/mgpro,n=6)肌酸激酶(U/L,n=6)肌酸激酶同工酶(U/L,n=6)再灌注損傷組 7.43±0.03 1.54±0.28 35.48±12.48 1249.50±211.51 966.84±263.80后適應(yīng)組 7.33±0.03＊ 1.12±0.37＊ 58.58±13.28＊ 582.50±263.15＊ 486.13±150.91＊乳酸組 7.32±0.07＊ 1.50±0.27△ 44.95±18.01△ 882.00±254.72＊ 690.03±329.64＊

缺血心肌組織線粒體吸光度：再灌注 1 h后連續(xù)30min乳酸組和后適應(yīng)組線粒體吸光度無明顯差異(P＞0.05);但兩組均高于再灌注損傷組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。再灌注 6 h后連續(xù) 30min,乳酸組和后適應(yīng)組線粒體吸光度均高于再灌注損傷組(乳酸組 15min和 30 min除外),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);乳酸組線粒體吸光度再灌注 6 h后連續(xù) 30min均顯著低于后適應(yīng)組(P＜0.05)。(表 3、4)

表 3 3組再灌注 1 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

表 3 3組再灌注 1 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05

組別 0min 1m in 5m in 15min 30m in再灌注損傷組 0.306±0.005 0.304±0.010 0.302±0.010 0.298±0.027 0.293±0.015后適應(yīng)組 0.355±0.006＊ 0.360±0.011＊ 0.358±0.013＊ 0.353±0.023＊ 0.348±0.026＊乳酸組 0.351±0.006＊ 0.350±0.008＊ 0.348±0.010＊ 0.342±0.020＊ 0.338±0.020＊

表 4 3組再灌注 6 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

表 4 3組再灌注 6 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05

組別 0min 1m in 5m in 15 min 30m in再灌注損傷組 0.316±0.005 0.314±0.012 0.312±0.018 0.308±0.022 0.303±0.017后適應(yīng)組 0.375±0.005＊ 0.372±0.016＊ 0.369±0.016＊ 0.363±0.028＊ 0.359±0.021＊乳酸組 0.341±0.006＊△ 0.338±0.006＊△ 0.334±0.018＊△ 0.329±0.020△ 0.320±0.017△

蛋白免疫印跡檢測磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶、Bcl-2和 Bax的表達(表 5)：乳酸組和后適應(yīng)組磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶和 Bcl-2表達較再灌注損傷組明顯升高(P＜0.01),乳酸組顯著低于后適應(yīng)組 (P＜0.05)。Bax呈現(xiàn)相反變化,乳酸組和后適應(yīng)組較再灌注損傷組明顯降低,乳酸組顯著高于后適應(yīng)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表 5 3組蛋白免疫印跡結(jié)果比較(n=6,±s)

表 5 3組蛋白免疫印跡結(jié)果比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05

組別 磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 Bcl-2 Bax再灌注損傷組 0.28±0.05 0.02±0.01 2.40±0.45后適應(yīng)組 2.77±0.79＊ 1.21±0.35＊ 0.37±0.11＊乳酸組 1.50±0.23＊△ 0.22±0.03＊△ 1.01±0.16＊△

心肌細胞凋亡：假手術(shù)組很少見到染色陽性的凋亡細胞。再灌注損傷組凋亡細胞明顯多于乳酸組(15.00±1.90 vs 12.83±2.48,P＜0.05)和后適應(yīng)組(15.00±1.90 vs 9.83±2.04,P＜0.05);乳酸組凋亡指數(shù)(12.83±2.48)%顯著高于后適應(yīng)組 (9.83±2.04)%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

心肌梗死面積：后適應(yīng)組心肌梗死面積(27.97±10.89)%較再灌注損傷組(45.66±10.81)%降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);乳酸組(38.84±7.50)%低于再灌注損傷組,高于后適應(yīng)組,但差異均未達統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

自 2003年 Zhao等提出缺血后適應(yīng)的概念后,多種屬研究均證實后適應(yīng)可有效減輕再灌注損傷,但其保護機制的研究目前多集中在胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)上,對最上游的觸發(fā)因子研究較少。新近 Cohen等[7,9]提出了后適應(yīng)的酸中毒假說,認為后適應(yīng)的保護作用緣于短暫缺血延長了局部組織的酸中毒,從而抑制了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放。繼而多項研究發(fā)現(xiàn)使用酸性灌注液[10-11]可以通過延長酸中毒發(fā)揮類似后適應(yīng)的保護作用。因為缺血所致組織酸中毒為代謝性酸中毒,主要成分是乳酸,后適應(yīng)短暫延長酸中毒即來自于乳酸沖散速度的減慢,所以使用乳酸模擬后適應(yīng)延長酸中毒理論上更接近真實的生理變化過程。本研究在缺血心肌局部注射乳酸,可有效模擬局部組織的酸中毒,術(shù)后 10min右心房血漿 pH值結(jié)果顯示乳酸組同后適應(yīng)組相似,說明本實驗方法較為成功的模擬了后適應(yīng)延長的局部組織酸中毒。

目前認為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放會引發(fā)線粒體腫脹,繼而膜間隙前凋亡因子釋放至胞漿導(dǎo)致細胞凋亡。本實驗顯示乳酸組在再灌注 1 h內(nèi)可以發(fā)揮較好的抑制作用,但再灌注 6 h后抑制作用較后適應(yīng)組明顯減弱,到第 15min和 30min時乳酸組的保護效應(yīng)幾乎消失。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶是后適應(yīng)的重要保護途徑;Bcl-2和 Bax是重要的線粒體調(diào)控因子,前者可抑制通透性轉(zhuǎn)換孔的開放,而后者作用與其相反。本研究發(fā)現(xiàn)乳酸組磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶、Bcl-2/Bax較再灌注損傷組明顯升高,但顯著低于后適應(yīng)組。這說明在此條途徑的激活上乳酸只是部分模擬了后適應(yīng),這與上述通透性轉(zhuǎn)換孔的變化相一致。

酸中毒假說認為后適應(yīng)的保護效應(yīng)緣于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的兩次抑制,第二次抑制需要氧自由基作為中間分子才能正常傳導(dǎo)。本研究結(jié)果也支持上述推論,乳酸組能抑制早期的通透性轉(zhuǎn)換孔開放,但未能抑制后期轉(zhuǎn)換孔開放。這可能緣于乳酸未顯著降低氧自由基的生成(丙二醛和超氧化物歧化酶可以部分反映氧自由基的含量),而后者既起到了信號傳導(dǎo)的作用,又因濃度過高損傷了心肌組織,故保護效果未能完全模擬。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)局部注射乳酸能較好模擬后適應(yīng)帶來的酸中毒延長,可部分模擬其保護效果。但要完全探明后適應(yīng)的最上游觸發(fā)因子,還需要進一步的深入研究。

[1] Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition ofmyocardial injury by ischem ic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning.American journal of physiology,2003,285：H 579-588.

[2] StaatP,RioufolG,Piot C,etal.Postconditioning the human heart.Circulation,2005,112：2143-2148.

[3] Philipp S,Yang XM,Cui L,et al.Postconditioning protects rabbit hearts through a protein kinase C-adenosine A2b receptor cascade.Cardiovascular Research,2006,70：308-314.

[4] 王禹,張永明,劉秀華,等.依達拉奉藥物后處理與缺血后處理對急性缺血再灌注心肌保護作用的對比實驗研究.中國循環(huán)雜志,2008,23：388-391.

[5] Argaud L,Gateau-Roesch O,Raisky O,et al.Postconditioning inhibits mitochondrial permeability transition.Circulation,2005,111：194-197.

[6] Bopassa JC,Ferrera R,Gateau-Roesch O,et al.PI 3-kinase regulates themitochondrial transition pore in controlled reperfusion and postconditioning.Cardiovascular Research,2006,69：178-185.

[7] Cohen MV,Yang XM,Downey JM.The pH hypothesis of postconditioning：staccato reperfusion reintroduces oxygen and perpetuatesmyocardial acidosis.Circulation,2007,115：1895-1903.

[8] 趙秀梅,孫勝,劉秀華.墊扎球囊法復(fù)制大鼠在體心肌缺血/再灌注模型.中國微循環(huán),2007,11：206-208.

[9] Cohen MV,Yang XM,Downey JM.Acidosis,oxygen,and interference withmitochondrial permeability transition pore formation in the early minutesof reperfusion are critical to postconditioning's success.Basic Research in Cardiology,2008,103：464-471.

[10] Inserte J,Barba I,Hernando V,et al.Effect of acidic reperfusion on prolongation of intracellular acidosis and myocardial salvage.Cardiovascular Research,2008,77：782-790.

[11] Fujita M,Asanuma H,Hirata A,et al.Prolonged transient acidosis during early reperfusion contributes to the cardioprotective effects of postconditioning.American Journal of Physiology,2007,292：H 2004-2008.

(編輯：王寶茹)

Cardio-Protection of Lactate on Post-Conditioning of Acute Myocardial Ischemia Reper fusion in Rats

ZHANG Guo-ming,WANG Yu,LI Tian-de,ZHANG Da-wei,LIU Xiu-hua,LIYu-zhen.
Department of cardiology,Chinese PLA General Hospital,Beijing(100853),China Corresponding Author：WANG Yu,Email：wangyuheart@yahoo.com.cn

Objective：To test the hypotheses of lactate mimicking cardio-protection of post-conditioning by prolonging local acidosis of acutemyocardial ischemia reperfusion in rats.

Methods：Seventy two ratswere randomized into 4 groups：Sham operation group,Reperfusion/in jury(R/Igroup),Post-conditioning(Postgroup),the animatswere treated with 4 cycles of 20/20 s of reperfusion/re-occlusion,and Lactate group,the animatswere treated withmicro-injection of lactate at ischemicmyocardium.There were 18 rats in each group.Blood was taken from right atrium 10minutes after reperfusion tomeasure pH.All rats wereexecuted atdifferent time points to examine the contents of malonic dialdehyde(MDA),superoride dismutase(SOD),and the absorption ofm itochondria inmyocardium.Western blotanalysis was used to analyze the expression of phosphorylated ERK 1/2(P-ERK),Bcl-2 and Bax.Myocardial apoptosis and infarct size were also determined.

Resu lts：Blood pH was sim ilar in Lactate group and Postgroup(P＞0.05)10minutes after the reperfusion.Compared with R/Igroup,themyocardial absorp tion in Lactate group and Post group were both decreased 1h after the reperfusion(P＜0.05),and this phenomenon was attenuated 6h after reperfusion(P＞0.05).The levels ofMDA and SOD inmyocardium were sim ilar in Lactate group and R/Igroup(P＞0.05).The expressions of P-ERK,Bcl-2and Bax in Lactategroup were higher than that in R/Igroup(P＜0.05),but lower than that in Post group(P＜0.05).Myocardial enzyme activity,apoptotic index and infarct size in Lactate group were decreased at different degree,butapop totic index was still higher than that in Post group(P＜0.05).

Conclusion：Lactate could partlym im ic the cardio-protection of post-conditioning,and briefprolonged local acidosis in ischemicmyocardium m ight be one of trigger factors in the complex mechanism of post-conditioning.

Post-conditioning;Reperfusion injury;Lactate;Acidosis;mitochond rail Permeability transition pore

國家自然科學(xué)基金(No.30740080)

100853 北京市,中國人民解放軍總醫(yī)院 心血管內(nèi)科 (張國明、王禹、李天德、張大為),病理生理學(xué)研究室 (劉秀華、李玉珍)

張國明 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病的基礎(chǔ)和臨床研究 Email：guomingheart@126.com通訊作者 ：王禹 Email：wangyuheart@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614(2010)01-0034-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2010.01.011

2009-07-08)

?臨床研究?