恒波長(zhǎng)同步熒光法測(cè)定吐溫80-硫酸銨液固萃取體系中綠色熒光蛋白標(biāo)記的融合蛋白

沈靜茹,靳光才,余學(xué)紅,韋 康,林 敏

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院國(guó)家民委分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430074;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院,武漢430074)

目前50%以上原核生物表達(dá)的重組蛋白都是通過(guò)末端接有六聚組氨酸(6xH is)得以純化[1],固定化金屬鰲合親和層析技術(shù)已成為基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一.王偉等[2]等用ProBand Resin親和層析柱,得到表達(dá)的酵母GGDP合酶融合蛋白;Yao-Ch iChung等[3]用固定化N i2+螯合親和層析提純綠色熒光蛋白,一次可達(dá)85%的純度;Pan L i等[4,5]通過(guò)裝載有N i2+的螯合層析柱純化大腸桿菌中綠色熒光蛋白,一次提純率可達(dá)90%;也有采用乙醇萃取[6]法純化綠色熒光蛋白的.上述方法有各自特點(diǎn),但也存在費(fèi)用昂貴、耗時(shí)、重現(xiàn)性不佳,有機(jī)溶劑易使蛋白變性失活等問(wèn)題.液-固萃取體系[7]費(fèi)用低廉、無(wú)需高檔儀器設(shè)備.若利用此體系分離純化各類(lèi)蛋白應(yīng)具有較大優(yōu)勢(shì).本文探究了在吐溫80-硫酸銨液固萃取體系中分離含綠色熒光蛋白的融合蛋白適用的熒光方法-恒波長(zhǎng)同步熒光法.運(yùn)用于該體系,初步探討了液-固萃取體系萃取綠色熒光蛋白的可行性.

1 試劑與儀器

1.1 試劑

酵母提取物與蛋白胨(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠);氨芐青霉素(Am p);異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,sigm a公司);聚乙二醇6000(分析純,上?；瘜W(xué)試劑廠,Japan進(jìn)口分裝);氯化亞砜(分析純,上海同方精細(xì)化工有限公司);三氯甲烷(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);Cu(Ⅱ)-IDAPEG6000-IDA-Cu(Ⅱ)修飾物(自制);菌蛋白質(zhì)溶液(取自工程菌).

1.2 儀器

D 40-1型電動(dòng)攪拌機(jī)(杭州儀表電機(jī)廠);78-1型磁力加熱攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠);手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);高速冷凍離心機(jī)(CR 22G型,日立公司);DYY-Ⅲ2電泳儀(北京六儀儀器廠);HS-3C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠);HY-4調(diào)速多用振蕩器(金壇市大地自動(dòng)化儀器);XW 微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);LS-55型熒光/磷光/發(fā)光光度計(jì)(PE公司).

2 結(jié)果與討論

2.1 工程菌的培養(yǎng)及蛋白的表征

2.1.1 配制L u ria-Bertan i(LB)培養(yǎng)基及滅菌

將適量酵母提取物、蛋白胨、N aC l調(diào)節(jié)pH 7.0.分裝至錐形瓶與小試管中,密封,高壓蒸汽滅菌,完畢后烘干備用.

2.1.2 用于SDS-PA GE電泳的蛋白獲取及SDSPAGE電泳

超凈工作臺(tái)紫外燈滅菌,取pQ E31-GFP與pGEM 單菌落接種于含氨芐青霉素(Am p)的LB培養(yǎng)基中,搖床中振搖培養(yǎng)過(guò)夜.從培養(yǎng)過(guò)夜的菌液中吸取少量轉(zhuǎn)接至含Am p的LB培養(yǎng)基的小管中,于搖床中培養(yǎng),至菌體OD600達(dá)到0.6～0.8.將已達(dá)到OD600要求的菌液用IPTG誘導(dǎo),于搖床中振搖培養(yǎng)4～24 h.未誘導(dǎo)的于37℃搖床中振搖培養(yǎng)16 h.高速離心除去培養(yǎng)基,水懸浮菌體,超聲波破碎.再高速離心,取適量的溶液加入等量上樣緩沖液,沸水中煮沸3～5m in,離心10m in,取上清液進(jìn)行電泳點(diǎn)樣.

蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜表征.根據(jù)L aemm li[8]方法進(jìn)行垂直電泳.5%濃縮膠和15%分離膠,電極緩沖液為T(mén) ris-G ly系統(tǒng)(pH 8.3).蛋白質(zhì)上樣量為20μL,考馬斯亮藍(lán)R 250染色.得到不同培養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)SDS-PA GE圖,見(jiàn)圖1.圖1中pQE31-GFP指含pQE31-GFP表達(dá)質(zhì)粒,該質(zhì)粒含氨芐青霉素抗性基因,可表達(dá)一個(gè)在29 kD上下含6 xH is和綠色熒光蛋白的融合蛋白.pGEM 指具有氨芐青霉素抗性,但不表達(dá)綠色熒光蛋白,可作為無(wú)表達(dá)的陰性對(duì)照菌株.

圖1 各種條件下蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of the p ro tein

圖1中B～ I條帶均在25～30 kD有一條清晰的條帶,符合目標(biāo)蛋白的條件,而對(duì)照菌株則在此間不存在清晰的條帶,說(shuō)明目標(biāo)蛋白已經(jīng)表達(dá)出來(lái).同時(shí)對(duì)比各個(gè)條帶發(fā)現(xiàn),當(dāng)誘導(dǎo)劑的濃度在0.4mm o l/L、誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí),誘導(dǎo)最明顯,如圖1中的C條帶.因此選擇誘導(dǎo)劑的濃度為0.4mm o l/L,誘導(dǎo)時(shí)間為4 h.

2.1.3 大量工程菌的培養(yǎng)及粗蛋白的獲取

經(jīng)過(guò)活化菌種(同前)、擴(kuò)大培養(yǎng)(同前)、誘導(dǎo)表達(dá)(同前)、菌體收集(同前)和表達(dá)產(chǎn)物收集(于高速離心機(jī)中10 000 r/m in,恒溫4℃離心30m in收集上清液,即為后續(xù)提純所需要的粗蛋白溶液,即菌蛋白原液).

2.2 目標(biāo)蛋白熒光測(cè)定表征方法探究

2.2.1 蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度

將自工程菌(含六聚組氨酸綠色熒光蛋白修飾融合蛋白)中得到的蛋白質(zhì)溶液,稀釋100倍后于LS-55型熒光/磷光/發(fā)光光度計(jì)儀上進(jìn)行熒光掃描,結(jié)果見(jiàn)圖2a發(fā)射光譜(Ex)和圖2b激發(fā)光譜(Em).調(diào)節(jié)狹縫寬度得到菌蛋白最佳測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)220 nm,發(fā)射波長(zhǎng)348 nm,激發(fā)波長(zhǎng)狹縫寬度(Em Slit)和發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度(ExSlit)均為12.5 nm.

圖2 菌蛋白質(zhì)溶液熒光光譜圖Fig.2 Fluo rescence spectra of the p ro tein

2.2.2 吐溫80-硫酸銨液固萃取體系各因素對(duì)蛋白質(zhì)熒光光譜的影響

配置濃度0.7%(質(zhì)量/體積)PEG修飾物,1.9m o l/L的硫酸銨溶液,5.4%(體積/體積)的吐溫80溶液(分別為液固萃取體系分離純化蛋白時(shí)體系各物質(zhì)的實(shí)際濃度),在激發(fā)波長(zhǎng)220 nm處,掃描上述各溶液熒光發(fā)射光譜、激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度均為12.5 nm,得三者的發(fā)射光譜掃描圖,見(jiàn)圖3.PEG修飾物和硫酸銨溶液無(wú)熒光現(xiàn)象,在348 nm處也未出現(xiàn)熒光峰,因此其對(duì)蛋白質(zhì)的熒光測(cè)定沒(méi)有影響;吐溫80溶液在348 nm處有很強(qiáng)的熒光吸收,將吐溫80溶液的濃度稀釋為0.024%(體積/體積),與蛋白質(zhì)原液稀釋100倍在同樣條件下掃描,得對(duì)比圖4.

由圖4知,在激發(fā)波長(zhǎng)為220 nm 處,狹縫寬度均為12.5 nm時(shí),吐溫80溶液與菌蛋白溶液兩者發(fā)射光譜基本重合,于340～350 nm處均有一明顯的峰.說(shuō)明吐溫的存在對(duì)蛋白質(zhì)的熒光測(cè)定有很大的影響,更說(shuō)明在液固萃取體系分離菌蛋白時(shí),用普通熒光法吐溫80會(huì)嚴(yán)重干擾菌蛋白的測(cè)定,由此得到的萃取分析數(shù)據(jù)不能指導(dǎo)分離工作,因此需要探究其它適用于吐溫80-硫酸銨液固萃取體系分離菌蛋白的熒光測(cè)定方法,以消除干擾.力求得到準(zhǔn)確的萃取分析數(shù)據(jù),對(duì)分離起指導(dǎo)作用.

圖3 修飾物、硫酸銨與吐溫80的熒光發(fā)射光譜圖Fig.3 Em spectra o fmodifier,amm onium su lfate and tw een 80

圖4 菌蛋白質(zhì)與吐溫80溶液的熒光發(fā)射光譜圖Fig.4 Em spectra of p ro tein and tw een80

2.3 液-固萃取體系中蛋白質(zhì)恒波長(zhǎng)同步熒光測(cè)定法研究

2.3.1 恒波長(zhǎng)同步熒光掃描菌蛋白質(zhì)溶液

對(duì)含綠色熒光蛋白的菌蛋白液和對(duì)照菌(pGEM)中提取的蛋白液進(jìn)行恒波長(zhǎng)同步熒光掃描時(shí),變換不同的波長(zhǎng)差(Δλ:10～150 nm),同時(shí)探究激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度對(duì)光譜峰的影響,確定恒波長(zhǎng)同步熒光的最佳掃描方式為:Δλ為20 nm,ExSlit為10 nm,Em Slit為15 nm,掃描速度(ScanSpeed)1 200 nm/m in,按最佳掃描方式得掃描圖5.

由圖5曲線1可知,蛋白質(zhì)的熒光光譜在287.50 nm以及487.19 nm處各有一個(gè)非常強(qiáng)的光譜峰,而對(duì)照菌中提取的蛋白質(zhì)僅在285.50 nm附近有光譜峰,其在487.19 nm處卻沒(méi)有光譜峰,可確認(rèn)487.19 nm處的峰為含綠色熒光蛋白的目標(biāo)蛋白特征光譜峰.可在此處建立綠色熒光蛋白的恒波長(zhǎng)同步熒光測(cè)定法,但能否作為吐溫80-硫酸銨液固萃取體系分離菌蛋白的熒光測(cè)定方法還需進(jìn)一步考察萃取體系中各因素的影響.

圖5 2種菌的蛋白質(zhì)恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖Fig.5 Constan t-w aveleng th synch ronous fluo rescence spectra o f p ro tein o f tw o k inds co li fo rm

2.3.2 液-固萃取體系各因素恒波長(zhǎng)同步掃描對(duì)菌蛋白原液的影響

(1)吐溫80、PEG修飾物、硫酸銨的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖.在最佳掃描條件下將萃取體系組成成分硫酸銨、吐溫80、PEG修飾物進(jìn)行恒波長(zhǎng)同步熒光掃描,得光譜圖6,由圖6可知三者均在487.19 nm處熒光強(qiáng)度較弱,說(shuō)明在體系中用恒波長(zhǎng)同步熒光法測(cè)定菌蛋白中目標(biāo)蛋白,組成萃取體系的各成分不會(huì)對(duì)菌蛋白的測(cè)定產(chǎn)生干擾.

(2)酸度對(duì)菌蛋白質(zhì)溶液熒光的影響.取1m L稀釋10倍的菌蛋白質(zhì)溶液,調(diào)節(jié)pH分別為4.2,4.9,5.1,5.9,6.3,定容至10m L,在同步熒光最佳熒光條件下,菌原液中綠色熒光蛋白的同步熒光強(qiáng)度變化如圖7所示.結(jié)果顯示pH＜5.1,菌蛋白液在487.19 nm處的熒光峰基本消失.

(3)PEG修飾物、硫酸銨、吐溫80溶液與蛋白質(zhì)混合液的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖.取3份1m L稀釋10倍的菌蛋白質(zhì)溶液,分別與0.7%(質(zhì)量/體積)的PEG修飾物、1.9m o l/L的硫酸銨溶液、5.4%(體積/體積)的吐溫80混合,于pH 6.3時(shí)掃描得各自的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖,見(jiàn)圖8.

圖6 吐溫80、PEG修飾物、硫酸銨的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖Fig.6 Constan t-w avelength synch ronous fluo rescence spectra o f tw een80,m od ifier,amm on ium su lfate

圖7 酸度對(duì)菌蛋白質(zhì)熒光光譜影響圖Fig.7 Effecto f acidity to flurescence spectra o f p ro tein

圖8 PEG修飾物、硫酸銨、吐溫80溶液分別與蛋白質(zhì)混合液的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜圖Fig.8 Constant-w avelength synch ronous flu rescence spectra ofp ro teinm ixedw ith PEGm odifier,amm onium su lfate and tw een 80

由圖8知,蛋白質(zhì)中加入硫酸銨及吐溫80溶液后,478.19 nm處蛋白的熒光峰未發(fā)生變化,加入PEG修飾物后,487 nm處的峰強(qiáng)度減弱了,可能為PEG修飾物與蛋白質(zhì)有相互作用引起的,但仍有明顯的菌蛋白熒光峰存在.

(4)實(shí)際萃取體系液相、固相的恒波長(zhǎng)同步熒光光譜.在2支比色管中加入一定量pH 6.2的硫酸銨溶液,適量PEG修飾物和吐溫80溶液,一支不加菌蛋白溶液,另一支加入0.3m L菌蛋白液,定容,萃取分離后液相和固相在最佳條件下用恒波長(zhǎng)同步熒光掃描,得圖9.

圖9 實(shí)際萃取體系液相、固相的同步熒光光譜Fig.9 Constan t-w avelength synch ronous flu rescence spectra of liqu id phase,so lid phase

由圖9a曲線1和圖9b曲線1可知,未加入菌蛋白萃取后的液相和固相487.19 nm波長(zhǎng)處無(wú)熒光蛋白的光譜峰;加入了0.3m L菌蛋白萃取后的液相掃描圖(圖9a曲線2)在487.19 nm處的熒光強(qiáng)度也很弱,但對(duì)應(yīng)固相的同步熒光光譜峰很明顯(圖9b曲線2),強(qiáng)度很大,說(shuō)明目標(biāo)蛋白大部分都萃取至固相中;圖9a曲線3說(shuō)明后加入萃取后液相的菌蛋白液中含綠色熒光蛋白的光譜峰在強(qiáng)度和位置上均未發(fā)生變化,說(shuō)明菌蛋白在此條件下無(wú)構(gòu)象上的變化,也說(shuō)明實(shí)際分離體系各因素對(duì)同步熒光測(cè)定法測(cè)定菌中綠色熒光蛋白沒(méi)有影響.

(5)萃取體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線.不同量菌原液在液固萃取分離后液相和固相中用恒波長(zhǎng)同步熒光法(即 Δλ= 20 nm,ExSlit 10 nm,Em Slit1 5 nm,ScanSpeed 200 nm/m in,487.19 nm)測(cè)定其熒光強(qiáng)度.得圖10.

圖10 萃取體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Standard curve of ex traction system

由圖10可知,萃取后的液相與固相的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)分別為R=0.999 35和R=0.997 48,說(shuō)明萃取體系其他因素不對(duì)綠色熒光蛋白的測(cè)定構(gòu)成干擾,用恒波長(zhǎng)同步熒光法測(cè)定吐溫80-硫酸銨液固萃取體系分離純化后液相和固相含綠色熒光蛋白的菌中融合蛋白是可行的.

2.4 液-固萃取體系純化菌蛋白的初步探究

2.4.1 修飾物對(duì)固相收得率的影響

1.9m o l/L硫酸銨溶液、5.4%(體積/體積)吐溫80溶液,PEG修飾物濃度分別為0,0.7%(質(zhì)量/體積),菌蛋白質(zhì)溶液均加入0.3m L(一一對(duì)應(yīng)參比),定容到10m L,液固分離后,用恒波長(zhǎng)同步熒光法測(cè)定液相和固相溶液487.19 nm處熒光強(qiáng)度,計(jì)算固相收得率(用萃取后固相的恒波長(zhǎng)同步熒光強(qiáng)度比萃取后固相和液相恒波長(zhǎng)同步熒光強(qiáng)度之和).計(jì)算一次萃取固相收得率分別為41.31%,76.90%.此結(jié)果說(shuō)明加入一定量的PEG修飾物后,吐溫80-硫酸銨液固萃取體系對(duì)目標(biāo)蛋白的固相收得率有明顯的提高.

2.4.2 酸度對(duì)固相收得率的影響

在一定條件下調(diào)節(jié)體系萃取pH至5.7,6.2,6.8,液固分離定容后測(cè)定熒光強(qiáng)度(一一對(duì)應(yīng)參比),計(jì)算一次萃取固相收得率.結(jié)果分別為74.91%,93.50%,84.10%.可知當(dāng)修飾物存在時(shí),酸度對(duì)收得率也有較大影響,pH 6.2時(shí),一次萃取固相收得率最高達(dá)93.50%;而不加修飾物,將pH調(diào)為6.2時(shí),一次萃取固相收得率為63.24%.結(jié)果表明酸度對(duì)固相收得率有明顯的影響(不調(diào)酸度的原始吐溫80-硫酸銨液固萃取體系pH 5.4,一次萃取固相收得率為41.31%),但PEG修飾物與目標(biāo)蛋白的特殊相互作用卻能大大提高液固萃取體系的分離選擇性.同時(shí)也說(shuō)明恒波長(zhǎng)同步熒光法適用于該體系中含綠色熒光蛋白的融合蛋白熒光測(cè)定.

3 結(jié)語(yǔ)

培養(yǎng)了含六聚組氨酸綠色熒光蛋白修飾融合蛋白的工程菌,從菌中得到了粗蛋白溶液,用SDSPA GE電泳初步驗(yàn)證了綠色熒光蛋白的表達(dá).用普通熒光和恒波長(zhǎng)同步熒光2種方式對(duì)從工程菌中收集的蛋白原液進(jìn)行了比較,確定了液固萃取體系中適用的恒波長(zhǎng)同步熒光法.通過(guò)調(diào)節(jié)酸度和提高選擇性運(yùn)用吐溫80-硫酸銨液固萃取體系初步分離了菌中目標(biāo)蛋白,調(diào)節(jié)酸度至pH 6.2時(shí)一次萃取固相收得率可達(dá)63.24%(不調(diào)酸度原始體系為41.31%),進(jìn)一步提高選擇性,加入聚乙二醇修飾物一次萃取固相收得率最高可達(dá)到93.50%.

[1] Ch iang YW,W u J C,W ang K C,et al.Efficien t exp ression o f histidine-tagged large hepatitis delta an tigen in bacu lovirus-transduced baby ham ster k idney cells.W o rld jou rnal o f gastroen tero logy[J].2006,12(10):1 551-1 557.

[2] 王 偉,孟 超,朱 平,等.綠色熒光蛋白標(biāo)記的表達(dá)載體pH is-EGFP的構(gòu)建[J].中國(guó)生物工程雜志,2005,25(9):35-39.

[3] Chung Yao-Ch i,L iu Hung-Jen,Hu Yu-Chen.Facile m on ito ring o f avian reovirusσB exp ression and pu rification p rocesses by tagged green fiuo rescen t p ro tein[J].Enzym e andM icrobial Techno logy,2004,35:494-500

[4] L i Pan,Guan Hong,L i Jin,et al.Hetero logous exp ression,pu rification,and characterization o f cytoch rom e P450sca-2 and m u tan ts w ith im p roved so lub ility in Escherich ia co li[J].Pro tein Exp ression and Pu rification,2009,65:196-203.

[5] L iu Zhu,Bartlow P,V arakala R,et al.U se of p ro teom ics fo r design o f a tailo red host cell fo r h igh ly efficien t p ro tein pu rification[J].Jou rnal of Ch rom atography A,2009,1 216:2 433-2 438.

[6] Sam ark ina O N,Popova A G.et al.U niversal and rap idm ethod fo r pu rification o f GFP-like p ro teins by the ethano l ex traction[J]. Pro tein Exp ression and pu rification,2009,65:108-113.

[7] 李步海,楊 波.吐溫-80鹽-水液-固萃取體系[J].科學(xué)通報(bào),1990(3):192-194

[8] L aemm liU K.C leavage of structu ral p ro teins du ring the assem b ly o f the head o f bacteriophage T 4[J].N atu re,1970,227:680-685.