氣-質(zhì)聯(lián)用法研究水溶性茯苓多糖提取方法

王 獻(xiàn),趙文杰,蘇 波

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,武漢430074)

茯苓(Po ria cocos)是一種藥用真菌[1].茯苓多糖主要分水溶性茯苓多糖和堿溶性茯苓多糖,水溶性茯苓多糖是雜多糖,含量較低,臨床證明是一種具有“扶正固體”、無任何毒副作用的抗腫瘤藥物[2].熱水浸提法和超聲法是提取水溶性多糖應(yīng)用較為廣泛的方法[3-5],傳統(tǒng)的測定方法為苯酚-濃硫酸法、蒽酮-濃硫酸法等[6-9].近幾年來,隨著多糖的分離分析和鑒定技術(shù)的發(fā)展,上述方法已由現(xiàn)代儀器分析技術(shù),尤其色譜以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所取代[10-13].一般化學(xué)法,手續(xù)繁雜,而且只能測定雜多糖的粗略總量[12],而GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)法具有準(zhǔn)確定性、分辨率高、靈敏度高等特點(diǎn)[14-15],大大提高了對多糖定量的可靠性.因此,本實(shí)驗(yàn)利用衍生化GCMS法和內(nèi)標(biāo)定量,優(yōu)選熱水浸提法和超聲波法提取水溶性茯苓多糖的提取條件,研究了得到更高多糖得率及更加可靠的提取水溶性茯苓多糖的條件.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

HP6890N-5973MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司);HP-5MSAglient(0.25mm×30m×0.25μm)彈性石英熔融毛細(xì)管柱(美國安捷倫科技有限公司);調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司);真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科學(xué)儀器研究所).

果糖(對照品(≥ 99.5%)上海晶純試劑有限公司),其它試劑均為分析純.茯苓為湖北省羅田縣規(guī)范化種植基地(GAP)的九資河茯苓(由湖北省中醫(yī)藥研究院藥物研究所鑒定).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GC-MS測定條件

載氣:氦氣;進(jìn)樣口溫度:260℃;柱流速:1mL/min,進(jìn)樣量:1μL;分流比為20∶1;氣化室溫度:260℃;升溫程序:起始溫度為50℃,8℃/min升溫至260℃;離子源:EI源;離子源溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;氣-質(zhì)接口溫度:280℃;電子能量:70eV.

1.2.2 樣品預(yù)處理

將塊狀茯苓60℃下真空干燥,粉碎至60目,密封于密封袋中備用.

1.2.3 水溶性茯苓多糖熱水浸提

水溶性茯苓多糖的提取步驟:茯苓粉末→浸泡過夜→加熱回流→抽濾→濃縮→乙醇沉淀→依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→茯苓多糖粗品.

1.2.4 水溶性茯苓多糖的超聲提取

水溶性茯苓多糖提取步驟:茯苓粉末→超聲提取→抽濾→濃縮→乙醇沉淀→依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→茯苓多糖粗品.

1.2.5 茯苓多糖水解和衍生化方法

取5mg茯苓多糖粗品,加入5mL1mol/L H2SO4水解,適量BaSO4調(diào)至中性,取1mL水解后樣品,加入100μL果糖(2mg/mL)做內(nèi)標(biāo)物,置于真空干燥箱中于65℃下烘干,冷卻后分別加入50 μLBSTFA 和DMF各50μL,充氮密封,于75℃下水浴30min,待樣品冷卻后各加入500μL丙酮,離心取上清液待GC-MS分析.

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)單糖GC-MS定量分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密量取D-木糖醇/D-葡萄糖/D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(2mg/mL)10,20,30,40,50,100,150,200,250μL于干凈干燥樣品瓶中,再分別加入2mg/mL的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL作內(nèi)標(biāo)物,按1.2.5中進(jìn)行衍生化及GC-MS分析.以對照品單糖衍生物峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積之比為縱坐標(biāo)Y,以對照品單糖衍生物質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)衍生物質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)X作圖即為標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS定性分析

圖1為熱水浸提茯苓多糖的GC-MS總離子流圖,圖2為單糖的質(zhì)譜圖.

圖1依出峰順序各單糖組分分別為序號(hào)1～10.通過GC-MS儀的NSIT圖譜庫分析保留時(shí)間18.44min的峰(1),對應(yīng)化合物名稱為:D-1,2,3,4,5-五環(huán)-O-(三甲基硅烷基)-木糖醇,分子式C20H52O5Si5,其質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)式見圖2.并且對照衍生化標(biāo)準(zhǔn)品D-木糖醇的GC-MS分析,獲知其保留時(shí)間、質(zhì)譜圖與峰(1)一致,確認(rèn)水溶性茯苓多糖中含有D-木糖醇.衍生化標(biāo)準(zhǔn)品D-果糖的GC-MSTIC譜圖有3個(gè)色譜峰,保留時(shí)間分別為19.47,19.57,19.70min,與圖1 中峰(3)、(4)、(5)一致,且其質(zhì)譜圖也完全相同,表明這3峰歸屬于所加入的內(nèi)標(biāo)物D-果糖的衍生物,即D-1,3,4,5,6,-五環(huán)-O-(三甲基硅烷基)-果糖,分子式為C21H52O6Si5,相同方法依次確認(rèn)了保留時(shí)間為20.54min和21.63min的峰(8)和峰(10)為衍生化D-葡萄糖;保留時(shí)間為21.24 min的峰(9)的化合物為衍生化D-甘露醇.研究表明超聲提取與熱水提取茯苓多糖的GC-MS總離子流圖的單糖出峰順序和成份相當(dāng)一致,只是糖類相對豐度略有不同.綜上所述,水溶性茯苓多糖中所包含的單糖成分主要有D-木糖醇、D-甘露醇、D-葡萄糖.

熱水浸提法為胞外提取法,超聲提取法為胞內(nèi)提取法,通過對兩者的GC-MSTIC譜圖分析,觀察到熱水浸提法譜圖峰數(shù)較多較雜,峰形較寬,且衍生化葡萄糖、甘露醇、木糖醇的相對豐度要高于超聲提取法.其主要差別可能來自于茯苓子實(shí)體結(jié)構(gòu)較為致密,超聲提取茯苓雖然經(jīng)過較高功率的超聲波破碎細(xì)胞壁進(jìn)行的胞內(nèi)提取[16]但總提取時(shí)間較短,而熱水胞外提取通過浸泡和較長時(shí)間的加熱回流有助于提取率的提高.

圖1 熱水浸提茯苓多糖的GC-M S總離子圖Fig.1 To tal ion ch rom atography(T IC)spectrum o f po riacocospo lysacchar by ho tw ater ex traction

圖2 D-1,2,3,4,5-五環(huán)-O-(三甲基硅烷基)-木糖醇的質(zhì)譜圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 M ass spectrum o f 1,2,3,4,5-pen tak is-O-(trim ethy lsily l)-D-xy lito land its chem ical structure

2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析

熱水浸提茯苓多糖以蒸餾水為提取劑,固液比(1∶20,1∶30,1∶40)、提取時(shí)間(3,4,5 h)、提取溫度(80,90,100℃)為影響茯苓多糖提取得率的主要因素,設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn).超聲提取茯苓多糖以蒸餾水為提取劑,固液比(1∶10,1∶20,1∶30,1∶40),超聲時(shí)間(15,30,45,60m in),超聲功率(100,200,300,400W)主要影響因素,茯苓多糖提取得率(其單糖組分得率之和)為指標(biāo),設(shè)計(jì)三因素四水平正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn).根據(jù)極差分析(見表1)可知,影響熱水浸提茯苓多糖得率的因素A＞B＞C,最佳條件為A 3B 1C2,即固液比1∶40,提取時(shí)間3 h,提取溫度90℃;影響超聲提取茯苓多糖的因素A＞C＞B,超聲提取茯苓多糖的最佳條件為A 4C1B4,即固液比1∶40,超聲功率為100W,提取時(shí)間60m in.

表1 極差分析Tab.1 Rang analysis tab le

2.3 茯苓中水溶性多糖含量的計(jì)算

在GC-M S優(yōu)選的最佳提取條件下,平行提取多糖3次,根據(jù)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定組成茯苓中水溶性多糖的主要3種單糖含量,從而計(jì)算出水溶性茯苓多糖的提取率及精密度,如表2所示.

表2 各單糖及總多糖提取率Tab.2 M ono saccharide and the to tal ex traction rate o f po lysaccharides

3 結(jié)語

運(yùn)用GC-M S法采用內(nèi)標(biāo)分析得出熱水提取和超聲提取水溶性茯苓多糖的平均提取率分別為13.0%和8.6%,所得提取率較高.2種提取方法相比較,超聲波法操作簡單,提取時(shí)間短,雜質(zhì)干擾少,但是熱水浸提法提取的茯苓多糖的得率高于超聲波法.本文中的2種方法得到茯苓水溶性多糖提取率均高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道值 2.4%[2]和0.239 7%[17].衍生化GC-M S法準(zhǔn)確可靠,分辨率高,靈敏度高,適合于研究水溶性茯苓多糖的提取,也適用于其他糖類物質(zhì)的研究.

[1] 王永江,吳學(xué)謙,毛建衛(wèi),等.茯苓多糖的提取及羧甲基化工藝研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2008,10(5):58-60.

[2] 黃才歡,李 炎,王秀芬,等.茯苓多糖的提取及結(jié)構(gòu)表征[J].廣州食品工業(yè)科技,2001,17(3):13-15.

[3] 張海榮,韓偉珍.微波法與傳統(tǒng)熱水法提取香菇多糖的比較研究[J].食品研究與開發(fā),2006,26(5):68-70.

[4] M ei Z,Zhan G,Cheungb P C K et al.M o lecu lar w eigh t and an ti-tum o r activity of the w ater-so lub le po lysaccharides iso lated by ho tw ater and u ltrasonic treatm en t from the sc lero tia andm ycelia of Pleu ro tus tuber-regium[J].Carbohyd rate Po lym ers,2004,56(1):123-128.

[5] 陳 莉,郁建平.茯苓多糖提取工藝的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2008,28(5)136-138.

[6] 廖丹葵,孫紅娜,王宗君,等.茶樹菇多糖的提取研究[J].食品研究與開發(fā),2007,28(1):16-18.

[7] 周燕霞,唐名林,殷輝安.茯苓中多糖的提取及含量測定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003,15(4)330-333.

[8] 孫元林,顧小紅,湯 堅(jiān),等.當(dāng)歸水溶性多糖分離、純化及結(jié)構(gòu)的初步分析[J].食品技術(shù)學(xué)報(bào),2006,25(1):1-4.

[9] 楊 銳,石深林,葛衛(wèi)紅.多糖的化學(xué)研究概況[J].中國藥師,2008,11(1):93-95.

[10] 郭方遒,聶娟偉,黃蘭芳,等.氣質(zhì)聯(lián)用法分析枸杞水溶性粗多糖中單糖組成[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2007,24(5):886-889.

[11] 張艷萍,俞遠(yuǎn)志.氣相色譜法分析羊棲菜多糖的組分及其含量[J].糧油食品科技,2006,14(2):50-51.

[12] 周 斌,張承明,張承聰,等.煙草中游離糖類的BSTFA衍生化與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法研究[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,16(3):239-242.

[13] ScalaroneD,Chian to reO,R iedo C.Gas ch rom atographic/m ass spectrom etric analysis o f on-line py ro lysis-sily lation p roductso fm ono saccharides[J].Jou rnalo f A naly ticaland A pp lied Py ro lysis,2008,83(2):157-164.

[14] 唐紅芳,鄭自強(qiáng),朱曉雨,等.銀杏葉中銀杏萜內(nèi)酯的GC-M S定性定量分析[J].中草藥,2003,34(3):214-217.

[15] 張艷萍,俞遠(yuǎn)志,等.氣相色譜法分析羊棲菜多糖的組分及其含量[J].糧油食品科技,2006,14(2):50-51.

[16] H romádkováZ,Eb ringerováA,V alachovic∨P.Com parison of classical and u ltrasound-assisted ex traction o f po lysaccharides from salvia o fficinalis L.[J].U ltrason ics Sonochem istry,1999(5):163-168.

[17] 連 賓,俞建平.樹舌、茯苓多糖的提取分離及組成[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào),2004,27,(1):120-122.