肺炎鏈球菌HMGS基因克隆及同源模建

賁亞琍,崔古貞,張青葉,劉德立＊

(1江漢大學(xué),武漢 430016;2華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 3華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院)

甲羥戊酸途徑是肺炎鏈球菌發(fā)育增殖必需的代謝途徑,甲羥戊酸的代謝過程是一種潛在的新型抗生素藥物作用靶標(biāo)。目前,用計算機(jī)分析三維結(jié)構(gòu),用同源模建的方法尋找結(jié)構(gòu)類似物來研究新藥的開發(fā)是一個新的領(lǐng)域,有非常高的實(shí)用價值。2006年6月 ～2008年 6月,本研究選擇肺炎鏈球菌的HMG-CoA合成酶 (HMGS)作為甲羥戊酸途徑的靶酶,以糞腸球菌 HMGS的晶體結(jié)構(gòu)為模板,通過SYBYL7.0軟件,構(gòu)建肺炎鏈球菌 HMGS的同源模建。

1 材料與方法

1.1 材料 肺炎鏈球菌購自武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。pET-28a由本室保存。氨芐青霉素、卡那霉素均購于武漢市亦新生物技術(shù)有限責(zé)任公司。DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、溶菌酶、TaqDNA聚合酶均購自 TaKaRa生物有限公司。S W ISS-MODEL sever,SYBYL Molecular Modeling Software,PROCHECK軟件。其余均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 肺炎鏈球菌 HMGS基因 PCR 根據(jù) Genbank中肺炎鏈球菌 HMGS基因序列 (No. AF290098)設(shè)計引物,正向引物和反向引物分別包含 EcoRⅠ和 NotⅠ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)總體積為50μl,包括 10×Buffer 5μl(含 Mg2+),10 mmol/L dNTP 2μl,10μmol/L正向、反向引物各 2μl,Taq DNA聚合酶 1μl,模板DNA 1μl,水37μl。PCR反應(yīng)程序:95℃加熱預(yù)變性 5 min后,95℃變性 30 s, 50℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,30個循環(huán),最后 72℃延伸 10 min,4℃保溫。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物。采用DNA限制性內(nèi)切酶酶切載體和樣品,低熔點(diǎn)瓊脂糖法回收DNA。DNA片段的回收采用DNA凝膠回收試劑盒。回收的載體與外源DNA片段按摩爾比 1∶10,并加入 1～3 U T4 DNA連接酶和 10×連接緩沖液,16℃連接過夜。重組質(zhì)粒經(jīng)適當(dāng)限制性內(nèi)切酶消化,電泳分析確證并鑒別外源片段及插入方向,或采用 PCR鑒定陽性重組子, DNA測序進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 同源模建 將 PCR獲得肺炎鏈球菌 HMGS序列輸入到 S W ISS-MODEL sever網(wǎng)站自動建模。經(jīng)初步序列同源模板搜索,選出了以下幾種原核生物同源性大于 30%的已知晶體結(jié)構(gòu)的蛋白作為模板分子,HMGS模板分子晶體結(jié)構(gòu) PDB代號分別為: 1X9E[1],1HDB[2],1YSL[1],1XPK[3],1TVZ[4],它們與目標(biāo)序列之間同源性在 47%～53%。按照已知晶體結(jié)構(gòu)的糞腸球菌 HMGS序列[1]與 SP-HMGS之間的疊合方式模建 SP-HMGS空間三維結(jié)構(gòu)。由S W ISS模建出的肺炎鏈球菌的 HMGS的初始空間三維結(jié)構(gòu) SYBYL軟件進(jìn)行加氫之后,再用 Powell方法和 Tripos力場 (SYBYL Molecular Modeling Software)進(jìn)行分子力學(xué)簡單優(yōu)化,能量優(yōu)化的收斂標(biāo)準(zhǔn)為變化梯度小于 0.05 kcal/mol。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌基因 HMGS基因克隆及序列鑒定以肺炎鏈球菌總DNA為模板,采用 PCR方法擴(kuò)增肺炎鏈球菌 HMGS基因 (SP-HMGS gene),以EcoRⅠ/NotⅠ分別酶切肺炎鏈球菌HMGS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和 pET28a載體并回收,將回收的HMGS基因亞克隆至載體 pET28a的 EcoRⅠ/NotⅠ位點(diǎn),構(gòu)建了重組子pET-HMGS,對HMGS基因進(jìn)行測序,結(jié)果如下。

2.2 肺炎鏈球菌 HMGS同源模建 將模建出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行簡單的動力學(xué)優(yōu)化后與模板蛋白分子進(jìn)行空間疊合。正如預(yù)料的一樣,模建的目標(biāo)蛋白質(zhì)的空間三維結(jié)構(gòu)整體走向與模板分子非常相似。

3 討論

隨著抗生素藥物的廣泛使用,肺炎鏈球菌耐藥性問題日漸突出。近年資料顯示抗青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)、耐紅霉素肺炎鏈球菌 (MRSP)及多重耐藥菌株在全球持續(xù)增加,給臨床治療帶來了困難。因此,開發(fā)新的抗生素藥物非常迫切。目前,利用已有的生物大分子靶標(biāo)的知識,以計算機(jī)為工具,通過理論模擬來指導(dǎo)和輔助新型藥物分子的設(shè)計,可以避免研發(fā)藥物的盲目性和縮短藥物開發(fā)的周期。本研究以HMGS作為肺炎鏈球菌甲羥戊酸途徑的靶酶,采用基因工程技術(shù)克隆了肺炎鏈球菌 HMGS基因,經(jīng)測序獲得肺炎鏈球菌 HMGS基因序列,其與已知晶體結(jié)構(gòu)的糞腸球菌 HMGS(I X9E)的基因有53%同源序列,以糞腸球菌 HMGS的晶體結(jié)構(gòu)為模板,通過 SYBYL7.0軟件成功地構(gòu)建了肺炎鏈球菌HMGS同源模建。用同源模建的方法分析了肺炎鏈球菌HMGS的三維結(jié)構(gòu),為根據(jù)肺炎鏈球菌HMGS同源模建尋找結(jié)構(gòu)類似物來開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。

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