HPLC-MS/MS法分析大鼠體內(nèi)淫羊藿素葡糖醛酸結(jié)合物

劉海培,孟繁華,郭繼芬,司端運,朱曉薇,趙毅民

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所,北京 100850;2.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;3.天津藥物研究院,天津 300193)

HPLC-MS/MS法分析大鼠體內(nèi)淫羊藿素葡糖醛酸結(jié)合物

劉海培1,2,孟繁華1,郭繼芬1,司端運3,朱曉薇2,趙毅民1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所,北京 100850;2.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;3.天津藥物研究院,天津 300193)

應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法鑒別大鼠血漿及尿糞中淫羊藿素葡糖醛酸結(jié)合物。生物樣品經(jīng)固相萃取法處理后,以V(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=45∶55∶1.5為流動相,通過Dikma C18柱分離,采用電噴霧離子四極桿串聯(lián)質(zhì)譜在負離子檢測方式下進行一級和二級全掃描質(zhì)譜分析。通過提高離子源內(nèi)的DP電壓,使待測物發(fā)生源內(nèi)裂解產(chǎn)生碎片離子,再對產(chǎn)生的碎片離子進行子離子掃描,可獲得相當(dāng)于三級質(zhì)譜分析的結(jié)果。根據(jù)待測物的色譜和質(zhì)譜信息,發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在大鼠體內(nèi)可代謝為1種雙葡糖醛酸結(jié)合物M 1和2種單葡糖醛酸結(jié)合物M 2、M 3。大鼠灌胃給予淫羊藿素后,在血漿和尿樣中可檢測到M 1、M 2和M 3,在糞便中僅檢測到M 2和M 3。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-M S/M S);淫羊藿素;葡糖醛酸結(jié)合物;代謝產(chǎn)物

淫羊藿素(icaritin,ICT)為來源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epimedium)植物的一種黃酮類成分,也可由淫羊藿苷經(jīng)纖維素酶水解得到,能明顯降低黑色素的濃度[1],且具有促進MCF27細胞和T47D細胞增殖的雌激素樣作用[2],其結(jié)構(gòu)示于圖1。為了了解淫羊藿素的體內(nèi)過程,我們已建立了 HPLC-MS/M S法[3]測定血漿樣品中淫羊藿素的濃度,并將此方法應(yīng)用到藥代動力學(xué)研究中。灌胃給予大鼠80 mg·kg-1淫羊藿素后,血漿中結(jié)合型淫羊藿素的Cmax和AUC0-∞分別約為原形的44倍和23倍,提示淫羊藿素在大鼠體內(nèi)主要以結(jié)合物形式存在。在上述研究的基礎(chǔ)上,本工作采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/M S)法對淫羊藿素在大鼠血漿、尿、糞中的代謝產(chǎn)物進行分析,發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在大鼠體內(nèi)可代謝為1種雙葡糖醛酸結(jié)合物M 1和2種單葡糖醛酸結(jié)合物M 2、M 3。

圖1 淫羊藿素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of icaritin

1 實驗部分

1.1 儀器

API3000液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國 AB公司產(chǎn)品,配有 Turbo Ionsp ray離子化源;Agilent 1100四元梯度泵和自動進樣器:美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 試劑和材料

淫羊藿素對照品(99.9%):由天津藥物研究院提供;抗壞血酸(分析純):購自北京化學(xué)試劑公司;乙腈(色譜純):購自美國 Sigma公司;乙酸(色譜純):購自美國 Tedia公司;甲醇(色譜純):購自美國Fisher公司;Bakerbond固相萃取柱(C18,100 mg/1 mL):購自美國Baker公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 Dikma C18柱(200 mm×4.6 mm×5μm):美國 Dikma公司產(chǎn)品;C18保護柱(4 mm×3.0 mm):美國 Phenomenx公司產(chǎn)品;流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=45∶55∶1.5;流速 0.6 mL ·min-1;進樣量 50 μL;柱溫25 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,負離子檢測,噴射電壓-4 000 V,源溫度400℃,霧化氣為6 unit,卷簾氣為11 unit,碰撞氣為7 unit,采用一級和二級全掃描質(zhì)譜法分析。

1.4 樣品處理

取200μL生物樣品(血、尿、糞),50μL 2.5 g·L-1抗壞血酸溶液和100μL磷酸二氫銨緩沖溶液(p H 3.99),加入200μL純凈水,渦流3 min,離心 10 min(9 500 r·min-1),取上清液至已活化好的 SPE C18柱,先用2×1 m L水沖洗,再用2×1 m L甲醇洗脫,將甲醇洗脫液于40℃下空氣吹干。殘余物用150μL流動相溶解后,吸取50μL進行 HPLC-M S/M S分析。

2 結(jié)果與討論

負離子檢測模式下,在大鼠灌胃給藥后的血樣和尿樣一級全掃描色譜圖上均可檢測到1個準(zhǔn)分子離子m/z737(M 1)和2個準(zhǔn)分子離子m/z561(M 2和M 3)的色譜峰。在糞樣的一級色譜圖上檢測到2個準(zhǔn)分子離子m/z561(M 2和M 3)的色譜峰。M 1的相對分子質(zhì)量比原形藥物多2×176 u,M 2和M 3的相對分子質(zhì)量比原形藥物均多 176 u。色譜保留時間順序為tR(M 1)＜tR(M 2)＜tR(M 3)＜tR(icaritin)。初步推測 M 1為淫羊藿素的雙葡糖醛酸結(jié)合物,M 2和M 3為淫羊藿素的單葡糖醛酸結(jié)合物。

對m/z737(M 1)和m/z561(M 2和 M 3)繼續(xù)進行二級質(zhì)譜分析,相應(yīng)的二級全掃描色譜圖和質(zhì)譜圖示于圖2和圖3。在M 1的二級質(zhì)譜圖中,有基峰為m/z737脫去一分子葡糖醛酸(176 u)后的m/z561,還有脫去二分子葡糖醛酸后的m/z385,以及葡糖醛酸離子m/z175和m/z113。m/z385與淫羊藿素在負離子模式下的準(zhǔn)分子離子相同。有文獻[4-5]報道,在負離子模式下,碎片離子m/z175和其脫去一分子水和一分子二氧化碳后的m/z113可以作為確定藥物葡糖醛酸結(jié)合物的直接證據(jù),據(jù)此推定M 1為淫羊藿素的雙葡糖醛酸結(jié)合物。在M 2和M 3的二級質(zhì)譜圖中,基峰均為m/z561脫去一分子葡糖醛酸后的m/z385,另外還均有m/z175和m/z113離子,因此推定M 2和M 3為淫羊藿素的單葡糖醛酸結(jié)合物。

為進一步證明M 1、M 2和M 3的二級質(zhì)譜中所產(chǎn)生的碎片離子m/z385為原形藥物淫羊藿素的碎片離子,還需對其進行下一級質(zhì)譜分析。但由于三重四極桿質(zhì)譜儀只能進行二級質(zhì)譜分析,因此通過將離子源內(nèi)的DP電壓由70 V提高到160 V,使M 1、M 2和M 3在離子源內(nèi)裂解產(chǎn)生m/z385碎片,然后使m/z385在第2個四極桿(即碰撞室)中發(fā)生碰撞誘導(dǎo)裂解,獲得相當(dāng)于三級質(zhì)譜分析的結(jié)果。在淫羊藿素對照品的二級質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn),淫羊藿素脫去B環(huán)3’位甲基后的m/z370、脫去C環(huán)8位2-羥基-2-甲基丙基后的m/z311、脫去B環(huán)3’位甲基和C環(huán)8位2-羥基-2-甲基丙基后的m/z297等碎片離子。將M 1、M 2和M 3的三級質(zhì)譜圖與淫羊藿素對照品的二級質(zhì)譜圖進行比較,發(fā)現(xiàn)它們具有相同的質(zhì)譜裂解特征,示于圖4,因此進一步證明了M 1、M 2和M 3是淫羊藿素的葡糖醛酸結(jié)合物。M 2和M 3具有相同的相對分子質(zhì)量和質(zhì)譜裂解碎片,但色譜保留時間不同,說明M 2和M 3為同分異構(gòu)體。

圖2 灌胃給予大鼠淫羊藿素后尿樣中M 1、M 2和M 3的二級全掃描色譜圖a.空白尿樣;b.灌胃給予80 mg·kg-1淫羊藿素后的大鼠尿樣Fig.2 Product ion scan chromatograms spectra of M 1,M 2 and M 3 in rat urine after oral administration a.blank urine sample;b.urine sample obtained after oral administration of 80 mg·kg-1 icaritin

圖3 M 1、M 2和M 3的二級全掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Product ion scan spectra of M 1,M 2 and M 3

圖4 淫羊藿素的二級質(zhì)譜圖及代謝物的三級質(zhì)譜圖a.淫羊藿素的二級質(zhì)譜圖;b.M 1的三級質(zhì)譜圖;c.M 2和M 3的三級質(zhì)譜圖Fig.4 product ion scan spectra of icaritin and full scan MS3 spectra of con jugates a.product ion scan spectrum of icaritin;b.MS3 spectrum of M 1;c.MS3 spectrum of M 2 and M 3

鑒于不易得到葡糖醛酸結(jié)合物對照品,我們只能依靠質(zhì)譜信息對M 1、M 2和M 3的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行推測。淫羊藿素結(jié)構(gòu)中含有4個羥基,其中包括3個酚羥基(黃酮母核的 3,5,7位)和1個醇羥基。據(jù)文獻[6]報道,酚羥基較醇羥基的反應(yīng)活性強,而黃酮類化合物的酚羥基反應(yīng)順序通常為7位＞3位＞5位。因此推測M 1為淫羊藿素的3,7位羥基與葡糖醛酸結(jié)合而成的代謝產(chǎn)物;M 2和M 3為淫羊藿素的3,7位羥基分別與葡糖醛酸結(jié)合而成的代謝產(chǎn)物,但具體結(jié)合位點還有待進一步研究。

[1]PARK J S,PARK H Y,RHO H,et al.Statistically designed enzymatic hydrolysis for op timized production of icariside IIas a novel melanogenesis inhibito r[J].J Microbiol Biotechnol,2008,18(1):110-117.

[2]葉海涌,劉 健,樓宜嘉.淫羊藿苷衍生物的制備及其雌激素樣作用研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報,2005,34(2):131-136.

[3]劉海培,孟繁華,郭繼芬,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠血漿中淫羊藿素[J].藥學(xué)學(xué)報,2009,44(10):1 140-1 144.

[4]王 玲,王英武,陳 剛,等.電噴霧-串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜法測定藥物的葡萄糖醛酸結(jié)合物[J].質(zhì)譜學(xué)報,2002,23(2):93-95.

[5]邢 杰,陳笑艷,張淑秋,等.液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法分析大鼠尿樣中的黃芩苷及其異構(gòu)體[J].質(zhì)譜學(xué)報,2004,25(3):129-133.

[6]MOHAM ED B,STéPHANE L,AZIZ A,et al.Hemisynthesis of all the O-monomethylated analogues of quercetin including the major metabolites,through selective p rotection of phenolic functions[J].Tetrahedron 2002,58:10 001-10 009.

Analysis of Glucuronide Conjugates of Icaritin in Rat by LC-MS/MS

L IU Hai-pei1,2,M ENG Fan-hua1,GUO Ji-fen1,SIDuan-yun3,ZHU Xiao-wei2,ZHAO Yi-m in1
(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,China;2.Tianjin University of Traditiona l Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research,Tianjin 300193,China)

The glucuronide conjugates of icaritin in rat plasma,urine and feces were analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-M S/MS).Samples were extracted using C18solid-phase extraction cartridges,and then separated on a Dikma C18column.Themobile phase was consisted ofV(acetonitrile)∶V(water)∶V(acetic acid)=45∶55∶1.5.Electrosp ray ionization(ESI)source was app lied.Full scan and second stagemass scan were performed in the negative ion mode.According to the chromatography and MS data,a di-glucuronide conjugate(M 1)and two mon-glucuronide conjugates(M 2 and M 3)of icaritin are identified in rat.M 1,M 2 and M 3 can be detected in plasma and urine,while M 2 and M 3 can be found in feces after oral administration of icaritin to rat.

high performance liquid chromatographic-tandem mass spectrometry(HPLCM S/M S);icaritin;glucuronide conjugate;metabolite

郭繼芬,女(漢族),內(nèi)蒙林西人,副研究員,藥物分析專業(yè)。E-mail:guojifen@sohu.com

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0376-04

2009-12-31;

2010-06-13

國家自然科學(xué)基金(81001468)資助

劉海培(1983～),女(漢族),河北衡水人,碩士研究生,藥物分析專業(yè)。E-mail:liuhaipei2007@163.com