質(zhì)譜在金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用

胡文兵,汪福意

(中國科學院化學研究所,北京分子科學國家實驗室,北京 100190)

質(zhì)譜在金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用

胡文兵,汪福意

(中國科學院化學研究所,北京分子科學國家實驗室,北京 100190)

研究細胞毒性金屬抗腫瘤藥物與蛋白質(zhì)的相互作用,以及這種相互作用對藥物的細胞攝入、轉(zhuǎn)運、代謝和生物利用度的影響,對金屬抗癌藥物的結(jié)構(gòu)設計和優(yōu)化,提高藥物的抗癌活性,降低毒副作用具有重要意義?；谲涬婋x技術(shù)的電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜能夠在分析檢測過程中很好的保留金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)的共價(配位)結(jié)合,獲得藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合位點的信息。同時,質(zhì)譜分析還具有靈敏度高,所需樣品量少,耗時短以及適用于分析復雜生物樣品等優(yōu)點,已成為研究金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用最強有力的工具,在為藥物發(fā)現(xiàn)提供大量化學、生物信息的同時,也極大地促進了質(zhì)譜技術(shù)自身的發(fā)展。本文將結(jié)合我們在金屬抗癌藥物相互作用組學研究中取得的最新進展,系統(tǒng)地總結(jié)、評述Bottom-up和Top-dow n質(zhì)譜分析方法在鉑、釕類金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的發(fā)展動態(tài),并分析這一前沿交叉領域未來的發(fā)展趨勢。

質(zhì)譜;金屬抗癌藥物;蛋白質(zhì);相互作用

40多年前,順鉑被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性,并于1978年進入臨床使用,開啟了金屬配合物作為抗癌藥物的新時代。順鉑和第二代鉑類抗癌藥物卡鉑,第三代鉑類抗癌藥物奧沙利鉑已廣泛應用于睪丸癌、卵巢癌、腦癌、膀胱癌等惡性腫瘤的治療中[1-2]。鉑類抗癌藥物與DNA分子內(nèi)的鳥嘌呤和腺嘌呤(主要是鳥嘌呤)配位,形成鏈內(nèi)或鏈間復合物,破壞DNA的構(gòu)象,從而阻止細胞內(nèi)DNA的復制,誘導癌細胞的凋亡或者壞死[3-5]。正因為DNA被認為是鉑類藥物的終極作用靶標,在過去的30年,研究者的目光主要集中在研究鉑類藥物與DNA的相互作用[1,4]。但是,鉑類抗癌藥物中的鉑原子具有很高的反應活性,除與DNA反應外,還易與蛋白質(zhì)分子中的親核基團結(jié)合,如半胱氨酸殘基的巰基、蛋氨酸殘基的硫甲基和組氨酸殘基的咪唑環(huán)等[6-8]。因而,鉑類金屬抗癌藥物經(jīng)靜脈注射給藥后,在達到終極作用靶標DNA前,會與血液中以及細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)廣泛作用,對藥物在人體內(nèi)的攝入、轉(zhuǎn)運、分布和生物利用度等起著至關(guān)重要的作用[6,9-10]。此外,如果藥物與蛋白質(zhì)之間的這種相互作用是不可逆的,則可能導致金屬藥物在組織中的累積和聚集,從而產(chǎn)生毒副作用,如中毒性腎毒性和耳毒性等[11]。鉑類金屬抗癌藥物與細胞內(nèi)負責藥物輸入和排泄的蛋白質(zhì)相互作用,如銅轉(zhuǎn)蛋白(CTR1)、腺苷三磷酸酶 7A/7B(A TPases7A/7B)等,與癌細胞獲得性或先天性的耐藥性密切相關(guān)[12]。

順鉑和第二代、第三代鉑類抗癌藥物與非DNA生物分子的相互作用導致嚴重的毒副作用,以及癌細胞對鉑類藥物先天性和獲得性的抗藥性,促使藥物化學家們將目光轉(zhuǎn)向其他金屬化合物。其中,三價釕配合物 NAM I-A、KP1019和二價釕芳烴基配合物是最有臨床應用前景的兩類抗癌候選藥物。三價釕配合物NAM I-A和KP1019已完成 1期臨床試驗[13-14]。NAM I-A只對轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞具有抑制活性,其終極作用靶標仍然不明確,有文獻報道認為其作用靶標可能是控制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)/酶,而不是DNA。In vivo研究表明,NAM I-A類抗癌化合物在靜脈注射給藥后,80%～90%的釕與血清白蛋白結(jié)合[13]。在臨床前實驗中,二價釕有機金屬配合物 HC11對異種移植的卵巢癌表現(xiàn)出與順鉑相當?shù)囊种苹钚訹15]。與鉑類藥物相似,DNA也是有機金屬釕抗癌化合物的潛在作用靶標[16-17]。但是,有機金屬釕抗癌化合物同樣對半胱氨酸、蛋氨酸[18]和組氨酸[19]以及多肽和蛋白質(zhì)[20-21]中的這3種氨基酸殘基表現(xiàn)出不同程度的反應活性。所以,研究金屬抗腫瘤藥物與蛋白質(zhì)的相互作用,以及這種相互作用對藥物細胞攝入、轉(zhuǎn)運以及代謝和生物利用度的影響,有利于金屬抗癌藥物的結(jié)構(gòu)設計和優(yōu)化,提高藥物的抗癌活性、降低毒副作用。

研究藥物與生物靶分子相互作用的方法主要有X-射線晶體衍射(XRD),核磁共振(NM R)波譜和質(zhì)譜(M S)。由于藥物-生物大分子復合物的單晶通常是在非生理環(huán)境下培養(yǎng)的,盡管XRD能準確的鑒定藥物與靶分子的結(jié)合位點,但晶體學解析數(shù)據(jù)有時并不能客觀、真實地反映藥物與生物分子相互作用的動態(tài)過程。NMR能直接分析溶液狀態(tài)下生物大分子及其復合物的三維結(jié)構(gòu),全面地記錄模擬生理條件下小分子和生物大分子相互作用的動態(tài)過程。但是,NMR在藥物相互作用研究中的應用還存在一些急需解決的問題,如耗樣量大、靈敏度低、只能分析單一組分的生物大分子-藥物復合物等。對復雜生物樣品,如血清、血漿或細胞內(nèi)低豐度、大分子量蛋白質(zhì)與藥物分子形成的復合物,或性質(zhì)相近的多種蛋白質(zhì)與藥物分子形成的復合物混合物,其動態(tài)相互作用研究及作用位點的鑒定仍然是NMR分析面臨的一大挑戰(zhàn)。近年來,隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,基于軟電離技術(shù)的電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜能夠在分析檢測過程中很好的保持金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)的共價(配位)結(jié)合,直接獲得藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合位點的信息[9]。同時,質(zhì)譜具有靈敏度高、所需樣品量少、耗時短,以及適用于分析復雜生物樣品等優(yōu)點[22-23],使其迅速成為研究金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用強有力的工具,大大促進了該領域的研究和發(fā)展[6]。通過質(zhì)譜分析不但能夠鑒定純蛋白與金屬抗癌藥物的作用位點,而且通過與各種色譜分離技術(shù)聯(lián)用(如二維液相色譜、二維凝膠電泳等)能夠直接分析復雜體系(如細胞或組織)中的蛋白質(zhì)與金屬抗癌藥物的相互作用,得到在生理環(huán)境下藥物相互作用的結(jié)構(gòu)信息,在為藥物發(fā)現(xiàn)提供化學、生物信息的同時,也極大地促進了質(zhì)譜技術(shù)自身的發(fā)展及其在生命科學領域的應用。

質(zhì)譜分析研究金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)的相互作用和結(jié)合位點,類似于鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的蛋白組學研究方法,主要有自下而上(Bo ttom-up)和自上而下(Top-dow n)兩種策略。其中Bottom-up比 Top-dow n方法發(fā)展得更為成熟,應用也更加廣泛。本文將結(jié)合我們在金屬抗癌藥物相互作用組學研究中取得的成果,系統(tǒng)地總結(jié)、評述Bottom-up和 Top-dow n質(zhì)譜分析方法在鉑、釕類金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的最新進展,并分析這一前沿交叉領域未來的發(fā)展趨勢。

1 Bottom-up方法在金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用

Bottom-up方法是將蛋白質(zhì)-金屬抗癌藥物復合物先酶解成肽段,肽段混合物經(jīng)液相色譜分離,再進行在線質(zhì)譜檢測。金屬藥物中過渡金屬鉑或釕的特征同位素分布非常有利于結(jié)合金屬抗癌藥物肽段的鑒定。如進一步將結(jié)合藥物的肽段裂解,可以將藥物在肽段上的結(jié)合位點精確到單個的氨基酸殘基上。由于Bottom-up方法將樣品酶解后再進行LC/M S分析,因此該方法更適合研究質(zhì)量數(shù)較大的蛋白質(zhì)和金屬抗癌藥物的相互作用,如轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白等。但在蛋白樣品的前處理過程中,為了避免金屬抗癌藥物從蛋白質(zhì)上解離或發(fā)生轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化,樣品前處理過程的時間應盡量縮短,并且盡可能少用含親核基團的試劑,如DTT等。

1.1 鉑類和釕類抗癌藥物與血清白蛋白的相互作用研究

血清白蛋白是人體血漿中豐度最高的蛋白質(zhì),它能結(jié)合和轉(zhuǎn)運多種內(nèi)源代謝產(chǎn)物和藥物[24]。目前絕大多數(shù)的金屬抗癌藥物都是經(jīng)靜脈注射的方式給藥,藥物在進入人體后與血清白蛋白發(fā)生廣泛的結(jié)合[6]。如順鉑注射后,大約80%的藥物與血清白蛋白結(jié)合[6,25],而釕抗癌藥物 KP1019的80%～90%也是結(jié)合在該蛋白上[13]。這些結(jié)合與藥物的活性、耐藥性和毒副作用密切相關(guān),研究它們的相互作用對這一類型抗癌藥物的結(jié)構(gòu)設計和優(yōu)化具有非常重要的意義。

Sheldrick小組[26]利用二維液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了順鉑與含有多種蛋白的人血清之間的反應。在將順鉑與人血清在體外孵化3 h后,離心超濾去除未反應的藥物分子,加入胰蛋白酶酶解,將酶解得到的肽段用二維液相色譜(2D-LC)分離后,經(jīng)質(zhì)譜檢測,得到鉑化肽段的二級質(zhì)譜圖。通過SW ISS-PORT數(shù)據(jù)庫的檢索,鑒定順鉑在血清白蛋白(HSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)等蛋白質(zhì)上的作用位點。研究發(fā)現(xiàn),順鉑與血清白蛋白的 Cys34、M et329、M et548、Tyr150(或 Tyr148)、A sp375(或 A sp376)氨基酸殘基配位結(jié)合。由于蛋白質(zhì)酶解鑒定的肽段覆蓋率低,有可能導致順鉑與 HSA部分作用位點的丟失,即出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

近期我們研究小組[21]利用LC-ESI-Q-TOF M S研究了HSA與兩種有機金屬釕抗腫瘤化合物[(η6-cymene)RuCl(en)]PF6、[(η6-biphenyl)RuCl(en)]PF6(en=ethylenediamine)的相互作用。為了提高肽段鑒定的覆蓋率,在蛋白質(zhì)樣品酶解前,先對蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-釕復合物進行變性、還原二硫鍵、封閉半胱氨酸殘基的處理,使HSA胰蛋白酶酶解肽段的鑒定率達77%。在此基礎上發(fā)現(xiàn)[(η6-cymene)Ru(en)]2+能與氨基酸殘基Cys34的巰基生成配位鍵,并誘導巰基氧化生成亞磺酸,對 HSA的抗氧化功能產(chǎn)生不可逆的影響,而[(η6-biphenyl)Ru(en)]2+受有機配體聯(lián)苯的位阻影響不能與Cys34結(jié)合。此外 ,[(η6-cymene)RuCl(en)]PF6、[(η6-biphenyl)RuCl(en)]PF6都能與 HSA表面的His128、His247、His510組氨酸殘基、Met298蛋氨酸殘基共價(配位)結(jié)合,且前者的結(jié)合程度比后者高。因此,研究表明,通過改變釕抗癌藥物的有機配體結(jié)構(gòu)可以很好地調(diào)控藥物與蛋白質(zhì)的反應活性。這一發(fā)現(xiàn)對進一步優(yōu)化有機金屬釕抗癌化合物的結(jié)構(gòu),提高藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運效率和生物利用度具有重要的意義。采用類似的質(zhì)譜分析方法,我們還研究了順鉑和 HSA的相互作用[27],結(jié)果顯示順鉑與 HSA的氨基酸殘基His67、His247形成鏈內(nèi)交聯(lián)復合物,而此位點正是 HSA轉(zhuǎn)運鋅離子的主要結(jié)合位點[28-29],因此順鉑與 HSA的結(jié)合可能干擾人體血液中鋅離子的轉(zhuǎn)運,導致鋅缺乏癥相關(guān)的毒副作用。早期已有文獻[30]報道,順鉑能夠誘導 HSA二硫鍵的斷裂,但熒光和原二色譜(CD)等不能確定二硫鍵斷裂的位置以及生成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),順鉑能夠誘導二硫鍵Cys124-Cys169斷裂,并且與還原的Cys124氨基酸殘基的巰基結(jié)合。由于二硫鍵對于維持蛋白構(gòu)型的穩(wěn)定有重要作用,因此順鉑誘導二硫鍵的斷裂可能對血清白蛋白的生物功能產(chǎn)生重要影響,如脂肪酸、膽紅素轉(zhuǎn)運等[31]。除此之外,順鉑還能與 HSA表面的His128和Met298氨基酸殘基共價(配位)結(jié)合。

1.2 鉑類和釕類抗癌藥物與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用研究

人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(h Tf)是由一條多肽鏈折疊而成含2個鐵離子結(jié)合部位的轉(zhuǎn)運蛋白,它通過與細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的特異性結(jié)合,將鐵離子轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)[32-33]。在生理條件下,血清轉(zhuǎn)鐵蛋白只有部分(約30%)被鐵離子占據(jù),因此轉(zhuǎn)鐵蛋白還能與進入血清的其他金屬離子結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運,如鉑、釕金屬抗癌藥物等[32,34]。通常腫瘤細胞的表面會過表達 Tf受體,轉(zhuǎn)鐵蛋白通過與抗癌藥物的結(jié)合可以提高藥物運輸?shù)陌邢蛱禺愋訹35]。因此,研究金屬抗癌藥物與轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用,有助于加深對金屬抗癌藥物在人體內(nèi)轉(zhuǎn)運和攝入過程的認識。

Dyson小組[36]利用LC-ESI-Q-TOF M S研究了順鉑與 Tf的相互作用,發(fā)現(xiàn)順鉑與 Tf的Thr457氨基酸殘基配位。Thr457位于轉(zhuǎn)鐵蛋白的C裂片,是鐵離子的結(jié)合位點之一。紫外和分子模擬的結(jié)果表明,順鉑、鐵離子在與 Tf的結(jié)合位點上存在競爭,并且順鉑與轉(zhuǎn)鐵蛋白C裂片的 Thr457殘基配位后,在空間上阻礙鐵離子在該位點的結(jié)合。而Sheldrick等[26]利用2DLC-ESI-M S/M S同樣研究順鉑與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用,發(fā)現(xiàn)順鉑除與 Thr457殘基結(jié)合外,還與 M et256、E265、Y314、E385殘基結(jié)合。不同研究小組得到有差異的結(jié)果可能是由于順鉑與轉(zhuǎn)鐵蛋白反應條件的不同而造成,如反應時間、溫度、p H值等,也有可能是由分離方法所引起。二維液相能更好的分離和富集鉑化肽段,從而提高質(zhì)譜的檢測限,獲得更多的結(jié)合位點信息。大量實驗表明,釕抗癌藥物的毒性比鉑類抗癌藥物低,且更易被腫瘤組織吸收,主要的原因被認為是釕可以模擬鐵離子與血漿中的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合,從而使得藥物更容易進入癌細胞內(nèi)[37]。因此研究釕基有機金屬抗癌藥物和轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合作用同樣具有非常重要的意義。我們研究小組利用LC-ESI-Q-TOF M S研究了轉(zhuǎn)鐵蛋白與[(η6-cymene)RuCl(en)]PF6,[(η6-biphenyl)RuCl(en)]PF6兩種有機金屬釕抗腫瘤化合物的配位反應[38]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種釕基配合物均可共價(配位)結(jié)合在 His261(His268)、His292、Tyr593(His597)和 His625殘基上。研究同時發(fā)現(xiàn),p-cymene配合物還可與 His554和 Tyr578氨基酸結(jié)合,biphenyl配合物則可能與Asp375氨基酸殘基發(fā)生相互作用。從中可以看出,釕金屬抗癌藥物與順鉑在轉(zhuǎn)鐵蛋白上的結(jié)合位點存在較大差異,釕抗癌藥物與組氨酸殘基配位能力強,與鐵離子在結(jié)合位點上不存在競爭關(guān)系,這也可能是釕抗癌藥物具有較低毒副作用的原因之一。

1.3 鉑類和釕類抗癌藥物與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用研究

金屬抗癌藥物通過被動擴散和蛋白質(zhì)(如銅轉(zhuǎn)蛋白、有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白等)的轉(zhuǎn)運進入細胞[12]。金屬抗癌藥物除與細胞核內(nèi)的DNA作用外,還與細胞質(zhì)中富含巰基的生物分子結(jié)合,如與谷胱甘肽、金屬硫蛋白、腺苷三磷酸酶7A/7B等的相互作用。越來越多的實驗表明,這些結(jié)合作用與金屬抗癌藥物的活性和抗藥性密切相關(guān),因此,金屬抗癌藥物與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究受到越來越多的重視。

Sheldrick等[39]研究了釕抗癌藥物[(η6-p-cymene)RuCl2(DM SO)]與大腸桿菌的蛋白質(zhì)相互作用。先將大腸桿菌與釕抗癌藥物孵化,再破碎細胞提取蛋白,加入胰蛋白酶酶解,二維液相分離,M S/M S鑒定藥物結(jié)合的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),該釕化合物主要與細胞內(nèi)的應激蛋白和解旋酶結(jié)合。得到這種研究結(jié)果的原因可能是在實驗中使用了高濃度的釕化合物(10 mmol·L-1)與大腸桿菌孵化,由于細胞的應激效應刺激了應激蛋白和解旋酶的大量表達,使得研究中主要發(fā)現(xiàn)釕抗癌藥物與這兩種蛋白的相互作用。由此可以看出,金屬抗癌藥物在細胞中的作用靶點研究需在接近人體內(nèi)的藥物濃度下進行才能得到真實的信息。近期,Ratanaphan等[40]報道利用LC-M S/M S研究乳癌抑制蛋白1(BRCA 1)與順鉑的相互作用。BRCA 1主要生物功能是參與維護染色體的完整性,臨床研究發(fā)現(xiàn),通過將BRCA 1失活可以提高癌細胞對藥物的敏感性,因此BRCA 1可作為鉑類抗癌藥物設計的一個潛在的增敏靶點。質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn),順鉑可以結(jié)合在單體BRCA 1的 His117殘基上,也可以形成BRCA 1的二聚體復合物,并且鉑化后的BRCA 1具有更高的熱穩(wěn)定性。

Bottom-up方法研究金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用通常需要經(jīng)過液相分離的步驟,以富集金屬藥物結(jié)合的肽段減少電噴霧過程中的抑制作用。但是,如果蛋白質(zhì)的質(zhì)量數(shù)較小(＜15 ku),金屬藥物與蛋白質(zhì)反應程度高,酶解后的肽段可以直接用M S檢測而不需要經(jīng)過分離步驟。細胞色素C質(zhì)量數(shù)較小,且含有易于與金屬抗癌藥物結(jié)合的 M et、His等殘基,因此通常被當作研究蛋白質(zhì)與金屬抗癌藥物相互作用的模型。最近 King等[41]報道直接使用高分辨的FT-M S研究細胞色素C與順鉑的相互作用,通過比較細胞色素C和細胞色素C-順鉑復合物酶解肽段的不同,找到與順鉑結(jié)合的肽段,再用M Sn方法最終確定順鉑結(jié)合在細胞色素C的 Met65殘基上。同樣,Gibson等[42]利用L TQ-Orbitrap研究卡鉑與細胞色素C的相互作用,發(fā)現(xiàn)卡鉑也是與M et65殘基結(jié)合。M esso ri等[43]利用 LC/M S、NM R研究了trans-[PtCl2{(E)-HN=C(OCH3)CH3}2]與細胞色素C的反應,同樣發(fā)現(xiàn)該鉑化合物與Met65殘基結(jié)合。Janiak等[44]采用LC/M S研究[Ru(bipy)(terpy)L](PF6)2(bipy=2,2’-bipyridine,terpy=2,2’:6,2’-terpyridine,L=imidazole)與細胞色素C的反應,確定該釕化合物結(jié)合在細胞色素C的His39殘基上。上述研究結(jié)果表明,在細胞色素C上,鉑類抗癌藥物優(yōu)先與S原子配位,而釕類抗癌藥物優(yōu)先與組氨酸殘基的N配位。因此,鉑類和釕類抗癌藥物在細胞內(nèi)的結(jié)合蛋白靶點可能存在差異,這可能是有機金屬釕抗癌化合物與順鉑沒有交叉抗藥性的原因之一。

2 Top-down方法在金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用

Top-dow n方法主要步驟是先將金屬藥物-蛋白質(zhì)復合物離子化,利用 CID、IRM PD、ECD等裂解技術(shù)將全蛋白裂解,分析鑒定含金屬藥物的碎裂片段,得到藥物在蛋白上的結(jié)合位點信息。Top-dow n方法優(yōu)點是,樣品不需酶解等前處理步驟,能夠最大限度的保留金屬藥物和蛋白質(zhì)相互作用的信息。但是該方法也存在較大的局限,由于現(xiàn)有蛋白質(zhì)裂解技術(shù)的限制,蛋白的裂解無法較好的控制,并且蛋白質(zhì)的裂解機理復雜,對于質(zhì)量數(shù)較大的蛋白質(zhì),大量的碎裂片段難以解析。因此,目前該方法只適用于研究質(zhì)量數(shù)較小的蛋白質(zhì)(＜10 ku)與金屬藥物的相互作用。

泛素是一個含有76個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),其廣泛存在于細胞質(zhì)和細胞核中。泛素在細胞的泛素化信號通路中起著關(guān)鍵的作用,與腫瘤的增值具有密切的關(guān)系,是金屬抗癌藥物在癌細胞中的潛在作用靶標[45-46]。Hartinger等[8]利用ESI-FT-M S/M S研究了順鉑,奧沙利鉑,反鉑與泛素蛋白質(zhì)的相互作用。在將鉑類藥物-泛素的復合物離子化后,通過CID方法直接裂解該蛋白復合物。分析含鉑的片段發(fā)現(xiàn),順鉑和奧沙利鉑結(jié)合在泛素 Met1殘基上,而反鉑結(jié)合在19Pro-Ser-A sp-Thr-Ile-Glu24的肽段上,但不能進一步確定結(jié)合的氨基酸殘基。此外,研究發(fā)現(xiàn)CID和IRM PD裂解方法都能獲得含鉑蛋白碎裂片段,而使用 ECD的裂解方法沒有發(fā)現(xiàn),原因可能是由于鉑離子捕獲電子使產(chǎn)生的含鉑片段中性化,而不能被質(zhì)譜檢測。

近期,Gomez等[47]利用 ESI-L IT-M S/M S研究了胰島素和順鉑之間的相互作用。胰島素同樣是一個小蛋白,含有2條肽鏈,被2條分子內(nèi)的二硫鍵相連。胰島素與順鉑反應最多可以結(jié)合3個順鉑分子。利用CID裂解和M Sn分析發(fā)現(xiàn),順鉑主要結(jié)合在胰島素B鏈的N端、His5和 His10殘基上。此外,研究結(jié)果顯示,順鉑還可能結(jié)合在Cys7殘基上,雖然該殘基在蛋白中形成了二硫鍵。金屬硫蛋白是一個低分子質(zhì)量,富含半胱氨酸,并且對多種金屬離子具有高親和性的蛋白質(zhì)。大量實驗表明,金屬硫蛋白和癌細胞與鉑類抗癌藥物的耐藥性密切相關(guān)[12,48]。Li等[49]利用 ESI-QQ-TOF研究了金屬硫蛋白和順鉑的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑可以結(jié)合在Cys5和Cys7殘基上。

3 結(jié)束語

基于軟電離技術(shù)的質(zhì)譜已成為研究金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)相互作用最強有力的工具,質(zhì)譜技術(shù)的進步大大促進了該領域的研究和發(fā)展。但是目前大部分的研究都是在模擬生理條件下將蛋白質(zhì)與金屬藥物孵化,并且為了提高反應中生成金屬藥物-蛋白質(zhì)復合物的比率,通常金屬藥物都是大大過量于蛋白質(zhì),而這種情況在生理環(huán)境中往往是不存在的。因此,體外實驗的研究結(jié)果可能與臨床應用中藥物的作用途徑存在較大差異。目前,在生理條件下研究金屬抗癌藥物與蛋白質(zhì)的相互作用,主要面臨著實際樣品復雜性高以及金屬藥物-蛋白質(zhì)復合物含量極低的挑戰(zhàn)。要解決這些問題,可以充分發(fā)揮ICP-M S和ESI-M S各自的優(yōu)勢,利用1D或2D的 HPLCICP-M S分析鑒定復雜生物樣品,如臨床樣品中與金屬藥物結(jié)合的蛋白質(zhì),確定藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的化學計量比。然后,從生物樣品中選擇性富集結(jié)合金屬藥物的蛋白,再應用Bottom-up或Top-dow n ESI-M S分析確定金屬藥物在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點。

[1]WANGD,L IPPARD SJ.Cellular processing of platinum anticancer drugs[J].Nature Review s D rug Discovery,2005,4(4):307-320.

[2]OZOLSR F.Ovarian cancer:New clinical approaches[J].Cancer Treatment Review s,1991,18(Supp l 1):77-83.

[3]TODD R C,L IPPARD SJ.Inhibition of transcription by platinum antitumor compounds[J].Metallomics,2009,1(4):280-291.

[4]KELLAND L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J].Nature Review s:Cancer,2007,7(8):573-584.

[5]JUNG YW,L IPPARD SJ.Direct cellular responses to platinum-induced DNA damage[J].Chemical Review s,2007,107(5):1 387-1 407.

[6]TIM ERBAEV A R,HARTINGER C G,ALEKSENKO S S,et al.Interactions of antitumor metallodrugs with serum proteins:Advances in characterization using modern analytical methodology[J].Chemical Review s,2006,106(6):2 224-2 248.

[7]GIBSON D.The mechanism of action of platinum anticancer agents-w hat do we really know about it?[J].Dalton Transactions,2009,48:10 681-10 689.

[8]HARTINGER C G,TSYB IN YO,FUCHSER J,et al.Characterization of platinum anticancer drug protein-binding sites using a top-dow n mass spectrometric approach[J]. Ino rganic Chemistry,2008,47(1):17-19.

[9]ESTEBAN-FERNANDEZ D,MORENO-GORDAL IZA E,CANASB,et al.Analyticalmethodologies for metallomics studies of antitumo r Ptcontaining drugs[J].Metallomics,2010,2(1):19-38.

[10]KHALA ILA I,BERGAMO A,BUSSY F,et al.The role of cisplatin and NAM I-A plasma-protein interactions in relation to combination therapy[J].International Journal of Oncology,2006,29(1):261-268.

[11]MORENO-GORDAL IZA E,CANASB,PALACIOSM A,et al.Novel insights into the bottomup mass spectrometry p roteomics approach for the characterization of Pt-binding proteins:The insulin-cisp latin case study[J].Analyst,135(6):1 288-1 298.

[12]HALL M D,OKABEM,SHEN D W,et al.The role of cellular accumulation in determining sensitivity to platinum-based chemotherapy[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology,2008,48:495-535.

[13]HARTINGER C G,JAKUPEC M A,ZORBASSEIFRIED S,et al.KP1019,a new redox-active anticancer agent-p reclinical development and results of a clinical phase I study in tumor patients[J].Chemistry&Biodiversity,2008,5(10):2 140-2 155.

[14]ANTONARA KIS E S,EMAD IA.Rutheniumbased chemotherapeutics:A re they ready for p rime time?[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2010,66(1):1-9.

[15]A IRD R E,CUM M IN GS J,R ITCH IE A A,et al.In vitro and in vivo activity and cross resistance p rofiles of novel ruthenium(II)o rganometallic arene comp lexes in human ovarian cancer[J].British Journal of Cancer,2002,86(10):1 652-1 657.

[16]CHEN H M,PARKINSON J A,PARSONS S,et al.Organometallic ruthenium(II)diamine anticancer comp lexes:A rene-nucleobase stacking and stereospecific hydrogen-bonding in guanine adducts[J].Journal of the American Chemical Society,2002,124(12):3 064-3 082.

[17]CHEN H M,PARKINSON J A,NOVA KOVA O,et al.Induced-fit recognition of DNA by o rganometallic comp lexes with dynamic stereogenic centers[J].Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(25):14 623-14 628.

[18]WANG F Y,CHEN H M,PARKINSON J A,et al.Reactions of a ruthenium(II)arene antitumo r complex with cysteine and methionine[J].Inorganic Chemistry,2002,41(17):4 509-4 523.

[19]WANG F Y,BELLA J,PARK INSON J A,et al.Competitive reactions of a ruthenium arene anticancer comp lex with histidine,cytochrome c and an oligonucleotide[J].Journal of Biological Ino rganic Chemistry,2005,10(2):147-155.

[20]WANG F Y,WEIDT S,XU J J,et al.Identification of clusters from reactions of ruthenium arene anticancer comp lex with glutathione using nanoscale liquid chromatography Fourier transform ion cyclotron mass Spectrometry combined with O-18-Labeling[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2008,19(4):544-549.

[21]HU W B,LUO Q,MA X Y,et al.A rene control over thiolate to sulfinate oxidation in albumin by organometallic ruthenium anticancer complexes[J].Chemistry-A European Journal,2009,15(27):6 586-6 594.

[22]王兆伏,宋鳳瑞,劉志強,等.質(zhì)譜技術(shù)在中藥小分子與生物大分子相互作用研究中的應用[J].質(zhì)譜學報,2010,31(3):129-137.

[23]楊何儀,蔡 耘,錢小紅.生物質(zhì)譜在核糖核酸領域的應用[J].質(zhì)譜學報,2004,25(1):52-60.

[24]CARTER D C,HO J X.Structure of serum-albumin[J].In Advances in Protein Chemistry,1994,45:153-203.

[25]DECONTIR C,TOFTNESSB R,LANGE R C,et al.Clinical and pharmacological studies with cis-diamminedichlo roplatinum(II)[J].Cancer Research,1973,33(6):1 310-1 315.

[26]W ILL J,WOL TERSD A,SHELDRICK W S.Characterisation of cisp latin binding sites in human serum proteins using hyphenated multidimensional liquid chromatography and ESI tandem mass spectrometry[J].Chemmedchem,2008,3(11):1 696-1 707.

[27]HU W B,LUO Q,WANG F Y,et al.Reactions of the anticancer drug cisp latin with human albumin can induce disulfide bond cleaveage and block themajo r zinc site novel binding sites of cisplatin to albumin revealed by LC-M S/M S:Occupancy of coo rdination sites of zinc and induced cleavage of disulfide bond cys 124-Cys 169[J].Submitted.

[28]BL INDAUER C A,HARVEY I,BUNYAN K E,et al.Structure,p roperties,and engineering of the major zinc binding site on human albumin[J].Journal of Biological Chemistry,2009,284(34):23 116-23 124.

[29]STEWART A J,BL INDAUER C A,BEREZENKO S,et al.Interdomain zinc site on human albumin[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(7):3 701-3 706.

[30]YOTSUYANAGI T,OHTA N,FUTO T,et al.M ultip le and irreversibile binding ofcis-diamminedichlo roplatinum(II)to human serum-albumin and its effect on warfarin-binding[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1991,39(11):3 003-3 006.

[31]TRYNDA-LEM IESZL,KOZLOWSKIH,KEPPLER B K.Effect ofcis-,trans-diamminedichloroplatinum(II)and DBPon human serum albumin[J].Journalof Inorganic Biochemistry,1999,77(3/4):141-146.

[32]SUN H Z,L I H Y,SADLER P J.Transferrin as a metal ion mediator[J].Chemical Review s,1999,99(9):2 817-2 842.

[33]MOOS T,MORGAN E H.Transferrin and transferrin recep to r function in brain barrier systems[J].Cellular and Molecular Neurobiology,2000,20(1):77-95.

[34]ZHAO Y Y,MANDAL R,L IX F.Intact human holo-transf errin interaction with oxaliplatin[J].Rapid Communications in Mass Spectrome-try,2005,19(14):1 956-1 962.

[35]KOSTOVA I.Ruthenium comp lexes as anticancer agents[J].Current Medicinal Chemistry,2006,13(9):1 085-1 107.

[36]KHALA ILA I,ALLARDYCE C S,VERMA C S,et al.A mass spectrometric and molecular modelling study of cisp latin binding to transferrin[J].Chembiochem,2005,6(10):1 788-1 795.

[37]ANGW H,DYSON PJ.Classical and non-classical ruthenium-based anticancer drugs:Towards targeted chemotherapy[J].European Journal of Ino rganic Chemistry,2006,20:4 003-4 018.

[38]GUO W,HU W B,WANG F Y,et al.Investigation of interactions between o rganometallic ruthenium anticancer comp lexes and transferrin by LC/MS[J].Submitted.

[39]W ILL J,KYASA,SHELDRICK W S,et al.Identification of(η6-arene)ruthenium(II)protein binding sites in E-coli cells by combined multidimensional liquid chromatography and ESI tandem mass spectrometry:specific binding of[(η6-p-cymene)RuCl2(DMSO)]to stress-regulated proteins and to helicases[J].Journalof Biological Inorganic Chemistry,2007,12(6):883-894.

[40]A TIPA IRIN A,CANYUK B,RA TANAPHAN A.Cisp latin affects the conformation of apo form,not holo form,of BRCA 1 ring finger domain and confers thermal stability[J].Chemistry&Biodiversity,2010,7(8):1 949-1 967.

[41]ZHAO T,KING F L.Direct determination of the p rimary binding Site of cisp latin on cytochrome c by mass spectrometry[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2009,20(6):1 141-1 147.

[42]GABBIAN IC,CASIN IA,MASTROBUON IG,et al.Peculiar mechanistic and structural features of the carbop latin-cytochrome c system revealed by ESI-MS analysis[J].Journal of Biological Inorganic Chemistry,2008,13(5):755-764.

[43]CASIN IA,GABBIAN IC,MASTROBUON IG,et al.Insights into the molecular mechanism s of protein platination from a case study:The reaction of anticancer Platinum(II)iminoethers with ho rse heart cytochrome c[J].Biochemistry,2007,46(43):12 220-12 230.

[44]YANG X J,DREPPER F,WU B,et al.From model compounds to protein binding:syntheses,characterizations and fluo rescence studies of[Ru II(bipy)(terpy)L]2+comp lexes(bipy=2,2’-bipyridine;terpy=2,2 ’:6,2 ’-terpyridine;L =imidazole,pyrazole and derivatives,cytochromec)[J].Dalton Transactions,2005,2:256-267.

[45]HOELLER D,HECKER C M,D IKIC I.Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in cancer pathogenesis[J].Nature Review s Cancer,2006,6(10):776-788.

[46]W ILL IAMSJ P,PH ILL IPS H IA,CAM PUZANO I,et al.Shape changes induced by N-terminal p latination of ubiquitin by cisp latin[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2010,21(7):1 097-1 106.

[47]MORENO-GORDAL IZA E,CANASB,PALACIOSM A,et al.Top-dow n mass spectrometric approach for the full characterization of insulincisp latin adducts[J]. Analytical Chemistry,2009,81(9):3 507-3 516.

[48]KN IPP M.M etallo thioneins and platinum(II)anti-tumor compounds[J].Current Medicinal Chemistry,2009,16(5):522-537.

[49]MANDAL R,L IX F.Top-dow n characterization of proteins and drug-protein comp lexes using nanoelectrosp ray tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2006,20(1):48-52.

Application of Mass Spectrometry in Research on the Interactions of Anticancer Metallodrugs with Proteins

HU Wen-bing,WANG Fu-yi
(Beijing National Laboratory for Molecu lar Science,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Science,Beijing 100190,China)

Investigating the interactions of anticancer metallodrugs with proteins,aswell as their effects on the process of drug transport,cellular up take,metabolism and bioavailability,is very important for structure-based design,improvement of activity and reduction of side effects of anticancer metallodrugs.The soft ionization mass spectrometry including ESI and MALD Ican greatly p reserve the coordination of drug molecules to biomolecules during the performance,and p rovide direct information on the binding sites of metallodrugson proteins.Additionally,mass spectrometry has many advantages such as high sensitivity,low sample consump tion,speed,suitable for comp lex biological samples and so on.Thus,it has become the most powerful tool for studying the interactions of anticancer metallodrugswith proteins.The increasing researcheson this field provide notonly valuable chemical and biological information for drug discovery,but also greatly promote mass spectrometry itself.Bases on the update progress of our ow n group on the interactomic studies of anticancermetallodrugs,wep resents a review of the latest achievements of research on the interactions of platinum-and ruthenium-based anticancer drugs(o r candidates)with proteins using bottom-up and top-down mass spectrometric approaches.A brief analysis on the possible future research trends and development in this area is also given.

mass spectrometry;anticancer metallodrug;protein;interaction

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0354-08

2010-10-08;

2010-11-10

國家自然科學基金(20975103,90713020),科技部973重大基礎研究項目(2007CB935601)資助

胡文兵(1983～),男(漢族),博士研究生,分析化學專業(yè)。E-mail:w enbhu@iccas.ac.cn

汪福意(1964～),男(漢族),研究員,博士生導師。E-mail:fuyi.wang@iccas.ac.cn