組織中全基因組DNA甲基化的液相色譜-串聯(lián)質譜分析

張俊杰,張立堅,劉春安,張良滔,蔡 春

(廣東醫(yī)學院,廣東 湛江 524023)

組織中全基因組DNA甲基化的液相色譜-串聯(lián)質譜分析

張俊杰,張立堅,劉春安,張良滔,蔡 春

(廣東醫(yī)學院,廣東 湛江 524023)

建立液相色譜-串聯(lián)質譜測定組織中全基因組DNA甲基化水平的方法。采用苯酚氯仿提取組織DNA,提取的DNA用88%甲酸在140℃下裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作內(nèi)標,經(jīng)N2吹干后,用甲醇溶解,以液相色譜-串聯(lián)質譜檢測胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量,并計算全基因組中DNA甲基化的水平。結果表明,胞嘧啶的線性范圍為1～100μg·L-1,相關系數(shù)為0.997 4,相對標準偏差為0.70%～4.09%;5-甲基胞嘧啶的線性范圍為1～50μg·L-1,相關系數(shù)為0.994 8,相對標準偏差為0.60%～4.81%。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的檢出限為1 pg,日內(nèi)相對標準偏差為1.86%～4.67%,日間相對標準偏差為3.72%～4.68%,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加樣回收率為86.52%～105.14%。本研究所建立的方法檢測組織中DNA甲基化程度,具有專一性強、操作簡便的優(yōu)點,能較好的滿足全基因組DNA甲基化檢測的要求。

DNA甲基化;液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS);胞嘧啶;5-甲基胞嘧啶

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶介導,在堿基上結合一個甲基的化學修飾過程。高等生物中的甲基化以胞嘧啶5位甲基化為主。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分,它是有核細胞特有的復制和轉錄后修飾,能夠在不改變基因組中堿基排序的情況下影響基因轉錄和表達,它涉及到個體發(fā)育,細胞增殖、分化、基因印跡、X染色體失活,基因表達調(diào)控和堿基突變等多方面的生物學功能[1-4],特別對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的生物學意義。腫瘤中DNA甲基化模式發(fā)生改變,表現(xiàn)為全基因組低甲基化和某些基因啟動子Cp G島區(qū)的高甲基化。這種甲基化模式的改變與腫瘤變化的關系已成為腫瘤研究的一個熱點。

DNA甲基化的準確檢測對于研究DNA甲基化變化極為重要。有文獻[5-7]報道,DNA經(jīng)酶解后,運用LC-M S/M S技術檢測5′-甲基胞嘧啶核苷和胞嘧啶核苷的含量,從而計算DNA甲基化程度。此外,也有文獻[8]報道,DNA通過化學方法裂解后,采用 GC/MS方法進行5′-甲基胞嘧啶和胞嘧啶含量的檢測。本工作使用化學方法將DNA裂解后,運用LC-M S/M S法測定5′-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的含量,評價DNA的甲基化程度,并用所建立的方法分析6例結腸癌病人腫瘤組織和正常結腸組織中全基因組DNA甲基化的變化。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

3K15臺式高速冷凍離心機:德國Sigma公司產(chǎn)品;UV-2100型紫外可見分光光度計:上海元析儀器有限公司產(chǎn)品;Aglient 1200-6430A液相色譜-串聯(lián)質譜儀:美國安捷倫公司產(chǎn)品。

胞嘧啶(cytosine,Cyt)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m Cyt):購于 Sigma公司;同位素胞嘧啶(cytosine-13C15N2):購于 Toronto research chemicals inc.。

氯仿,異戊醇,十二烷基磺酸鈉(SDS),無水乙醇,甲酸,乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和鹽酸(HCl)均為分析純;乙腈 (色譜純)/甲酸胺和甲酸(色譜純);實驗用水為M illi-Q超純水;三羥甲基胺基甲烷(Tris)和 Tris飽和酚為生化試劑。

1.2 儲備液和工作液的配制

1.2.1 儲備液的配制 準確稱取10 mg Cyt和5mCyt,用甲醇溶解定容至250 m L,得40 mg·L-1Cyt和 5m Cyt標準儲備液;取 10 mg Cyt13C15N2內(nèi)標物,用甲醇溶解后,置于250 mL容量瓶中,定容至刻度,得 40 mg·L-1Cyt13C15N2標準儲備液。所有儲備液在-20℃冰箱保存,待用。

1.2.2 工作液的配制 臨用時取Cyt儲備液,加入甲醇 ,稀釋成濃度為 100、75、50、40、25、10、7.5、5、2.5和 1μg·L-1工作液;取 5mCyt儲備液 ,加入甲醇 ,稀釋成濃度為 50、40、25、10、7.5、5、4、2.5、1和 0.5μg·L-1工作液;臨用時取 40 mg·L-1的Cyt13C15N2標準儲備液,加入甲醇,稀釋成濃度為40μg·L-1的Cyt13C15N2內(nèi)標工作液。

1.3 樣品處理

取結腸癌病人手術后的少量腫瘤組織和腫瘤旁正常結腸粘膜組織,置于-70℃冰箱保存。

1.3.1 DNA提取 取 0.05 mg組織,加入0.12 mL蛋白酶 K(20 g·L-1)、4 mL Tris-HCl-EDTA(TE)緩沖液和0.48 m L 10%SDS,45℃水浴過夜,加入V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1進行提取,搖勻6 000×g離心 5 min,取上清,重復提取 1次;再加入V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1,搖勻 6 000×g離心5 min;取上清加入1/10倍體積的3 mol·L-1醋酸鈉和2.5倍的無水乙醇,12 000×g離心5 m in,倒去溶液,加入1 m L TE緩沖液溶解。用紫外可見分光光度計檢測 DNA純度,當A260nm/A280nm=1.7～1.9時,視為純DNA。若有RNA污染加入RNase A,重復以上步驟。

1.3.2 DNA裂解 取約2.5μg DNA放入反應瓶中,用 N2吹干,然后加入0.2 mL 88%甲酸,140℃反應90 min,待其冷卻至室溫后,用N2吹干,加入400μL甲醇溶解,15 000×g離心4 min,取上清液,LC/M S分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件 BEH H IL IC色譜柱(1.7μm×2.1 m×100 mm,Waters公司產(chǎn)品);流動相:A為0.1%甲酸銨,B為乙腈;流速:0.4 m L·min-1;柱溫為室溫,進樣量5μL;洗脫程序:0～1 min A為10%,1～2 min A從10%變?yōu)?50%,2～2.5 min A為 50%,2.5～8 m in A從50%變?yōu)?0%。

1.4.2 質譜條件 電噴霧正離子電離模式,離子源溫度300℃;噴霧電壓3.5 kV,噴霧氣流量9 L·min-1;入口電壓:Cyt和5m Cyt為114 V,Cyt13C15N為115 V。采用多反應監(jiān)測模式檢測;碰撞能量:Cyt和5mCyt為20 V,Cyt13C15N為16 V。Cyt定量離子m/z112/95,輔助定量離子m/z69;5m Cyt定量離子m/z126/109,輔助定量離子m/z83;Cyt13C15N定量離子m/z115/97,輔助定量離子m/z115/70。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標法定量,以w(5mCyt)/[w(5mCyt)+w(Cyt)]×100%的方式表示DNA甲基化程度,Excell進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 5mCyt和Cyt質譜圖

分別加入5μL 1 mg·L-1Cyt、40μg·L-1Cyt13C15N2和 1 mg·L-15mCyt標準溶液,經(jīng)LC-M S/M S分析,其質譜圖示于圖1。圖1中,m/z112([M+H]+)、m/z115([M+H]+)和m/z126([M+H]+)分別為 Cyt、Cyt13C15N2和5m Cyt分子離子峰;m/z112/95和m/z126/109分別為Cyt和5mCyt的主要碎片離子,因此選用m/z112/95和126/109作為Cyt和5m Cyt的定量檢測。

圖1 Cyt(a)、Cyt13 C15 N2(b)和5mCyt(c)的子離子圖Fig.1 Product ion scan of Cyt(a),Cyt13 C15 N(b)and 5mCyt(c)

2.2 Cyt和5mCyt色譜條件

實驗中所需分離的嘧啶為堿性物質,因此采用適合于低p H值流動相的 H IL IC柱,對甲酸銨-乙腈、乙腈-甲酸溶液等多種流動相進行實驗。結果表明,以乙腈-0.1%甲酸銨溶液為流動相,流速0.4 m L·min-1;洗脫條件:0～1 min A為10%,1～2 m in A從 10%變?yōu)?50%,2～2.5 min A為50%,2.5～8 min A從50%變?yōu)?0%時得到的峰形最好,示于圖2。

圖2 標準品Cyt(a),Cyt13 C15 N2(b)和5mCyt(c)的M RM圖Fig.2 M RM of Cyt(a),Cyt13 C15 N2(b)and 5mCyt(c)in standard solution

2.3 線性范圍及精密度實驗

混合標準液包括5mCyt和Cyt,其中質量濃度系列為 0.5、1、2.5、4、5、7.5、10、25、40 和 50 μg·L-1,Cyt質量濃度系列為 1、2.5、4、5、7.5、10、25、40、50、75 和 100 μg·L-1,加 入40μg·L-1Cyt13C15N2作內(nèi)標,進樣 5次。分別以Cyt和5m Cyt質量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線,并以信噪比為3確定樣品的最低檢測限。結果表明,Cyt和5m Cyt的檢出限為 1 pg,Cyt的線性范圍為 1～100 μg·L-1,標準曲線為y=1.258 0x-0.625 5,相關系數(shù)R2為0.997 4,相對標準偏差 RSD為0.70%～4.09%;5mCyt的線性范圍為1～50 μg·L-1,標準曲線為y=1 216.621 2x-593.699 8,相關系數(shù)R2為0.994 8,相對標準偏差RSD為0.60%～4.81%。

2.4 重現(xiàn)性實驗

取同一樣品,按 1.3方法制備 3份,測定Cyt和5mCyt兩個色譜峰相對豐度的RSD列于表1。

表1 定量測定結腸癌組織中Cyt和5m Cyt的重現(xiàn)性Table 1 Reproducibility of Cyt and 5mCyt in colon cancer

2.5 穩(wěn)定性實驗

取同一DNA樣品試液,在-20℃分別保存2、4、6、8、10 h 后 ,測定 Cyt和 5mCyt兩個定量質譜峰相對豐度的 RSD分別為1.86%和4.67%。

取同一DNA樣品試液,在-20℃分別保存1、2、3、4、5 d 后 ,測定 Cyt和 5mCyt兩個定量質譜峰相對豐度的RSD分別為3.72%和4.68%。

2.6 回收率實驗

取同一結腸癌病人的腫瘤DNA溶液,經(jīng)88%甲酸在140℃下裂解后,分別加入400μL 50、10、1和 0μg·L-1的 Cyt和 5m Cyt,N2吹干,加入甲醇溶解,15 000 r·min-1離心5 min,取上清液,用于LC/M S分析。測定Cyt回收率分別為87.38%、105.14%和96.18%;5m Cyt回收率分別為89.58%、86.52%和94.52%,其結果列于表2。

2.7 結腸癌組織樣品分析

利用上述方法檢測了6例結腸癌組織中DNA甲基化水平,結腸癌患者正常組織和腫瘤組織甲基化分析結果列于表3。實驗結果表明,癌組織的甲基化水平低于相應的正常組織,這與文獻[9]報道一致,說明本方法可以很好地用于全基因組DNA甲基化水平的檢測。

表2 樣品添加回收率實驗(n=3)Table 2 Recoveries of Cyt and 5m Cyt from spiked sam ples(n=3)

表3 結腸癌和正常組織樣品甲基化分析結果Table 3 Results of contents in colon cancer tissuesand normal tissues

3 討論

目前檢測基因組DNA甲基化主要有SssI甲基轉移酶法和測序法,其中SssI甲基轉移酶法由于SAM和SssI甲基轉移酶性質不穩(wěn)定,易造成實驗結果誤差比較大,必須設立自身對照來標化實驗數(shù)據(jù);測序法需要大量的克隆測序,較為繁瑣[10]。最近報道[11-13],LC-M S/M S測定嘧啶核苷,此方法需要核酸酶、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶等酶水解DNA,由于酶活性的影響可能存在由于酶解不完全帶來的誤差。另有報道[8]將DNA用化學方法裂解為嘧啶后,通過衍生用GC/M S測定甲基化胞嘧啶和胞嘧啶的含量,該方法中嘧啶的衍生增加了操作的難度。本方法通過化學裂解DNA,既排除酶解法可能帶來的誤差,又不需要衍生,大大簡化了操作。

胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在C 18柱上沒有保留,改變洗脫溶劑也無法解決,改用適合堿性化合物分析的 H IL IC柱后,胞嘧啶和5-甲基嘧啶實現(xiàn)了分離,并發(fā)現(xiàn) H IL IC柱比C 18柱的靈敏度高,這可能與 H IL IC柱使用高比例有機相有關。

用乙腈和0.1%甲酸作為流動相時,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在柱上的保留時間基本相同;當用p H 4.5～6的乙酸-乙酸銨緩沖液作流動相時,色譜峰發(fā)生分岔的現(xiàn)象;而用p H 3.6的乙酸-乙酸銨緩沖液作為流動相,色譜峰沒有分岔,但是重現(xiàn)性不好,提示p H值和緩沖體系對胞嘧啶和5-甲基-胞嘧啶的分析影響比較大;當改用乙腈和0.1%甲酸銨水溶液作流動相時,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶基本分離,且重現(xiàn)性較好。

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Analysis of Global DNA Methylation in Tissue by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Jun-jie,ZHANG Li-jian,L IU Chun-an,ZHANG Liang-tao,CA IChun
(Guangdong M ed ical College,Zhanjiang 524023,China)

Global DNA methylation in tissue was determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-M S/M S).DNA w as extracted by phenol-chlo roform,hydrolyzed using 88%formic acid at 140 ℃,spiked with cytosine-2,4-13C2,15N2as internal standard,reconstituted in methanol and analyzed by LC-M S/M Swith multip le reaction monitoring mode,to reflect the global DNA methylation level of the tissue.Results show that the limit of quantification is 1μg·L-1for both Cytosine(Cyt)and 5-methylcytosine(5m Cyt),and the linear rangesof calibration curve are 1—50μg·L-1and 1—100μg·L-1for 5mCyt and Cyt,respectively,with correlation coefficient higher than 0.99.The relative standard deviations(RSDs)are 0.70%—4.09%and 0.60%—4.81%for Cyt and 5mCyt,respectively.The intra-day precision exp ressed as RSD ranges from 1.86%to 4.67%,while the inter-day values f rom 3.72%to 4.68%.The recovery ratio of method varies from 86.52%to 105.14%.The method is simple,and can be used for detection of Cyt and 5mCyt,thus enabling the evaluation of global DNA methylation.

DNA methylation;liquid chromatography-tandem mass spectrum(LC-MS/M S);cytosine;5-methylcytosine

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0326-05

2010-06-30;

2010-09-29

張俊杰(1985～),男(漢族),廣東東莞人,碩士研究生,藥物分析與儀器分析專業(yè)。E-mail:zhjunjie357753@163.com

蔡 春(1961～),男(漢族),廣東湛江人,教授,從事生物醫(yī)學分析研究。E-mail:caichun@gdmc.edu.cn