大鼠實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)中Integrin－αm的表達(dá)變化

喬 婷，陳 杰

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071;青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附院，山東 青島 266071)

錯(cuò)牙合畸形是口腔科的常見(jiàn)病多發(fā)病，錯(cuò)牙合畸形正畸治療可造成牙周、牙體、咀嚼肌、顳下頜關(guān)節(jié)等組織結(jié)構(gòu)的損傷。患者臨床表現(xiàn)為自發(fā)痛、觸痛、痛覺(jué)過(guò)敏等癥狀和體征。疼痛的產(chǎn)生是正畸治療中最常見(jiàn)和最棘手的問(wèn)題，疼痛令人產(chǎn)生不愉快的感覺(jué)，從而使患者懼怕正畸治療，有的甚至放棄正畸治療。正畸治療所導(dǎo)致的口面痛是臨床口腔科常見(jiàn)的慢性疼痛。疼痛通常在加力幾小時(shí)后出現(xiàn)，持續(xù)幾天后消失。目前對(duì)正畸致痛機(jī)制的研究大多局限于牙周組織內(nèi)的神經(jīng)改變，而對(duì)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元胞體及其中樞端改變的研究很少。傳導(dǎo)口腔頜面部疼痛的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元位于三叉神經(jīng)節(jié)(TG)，其樹(shù)突伸向外周組織，感覺(jué)外周刺激;中樞突將外周信息傳至三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Vc)，在此中繼后傳至上位腦中樞，完成初級(jí)感覺(jué)信息的傳遞。因此，探討在正畸加力狀態(tài)下，這些神經(jīng)元上特異表達(dá)的受體、通道或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)生的可塑性變化，有助于闡明正畸疼痛的發(fā)病機(jī)制。慢性疼痛是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，尋找正畸疼痛的發(fā)生機(jī)制及變化規(guī)律可以有效地減輕治療過(guò)程中的疼痛，同時(shí)也體現(xiàn)醫(yī)學(xué)的人文關(guān)懷。炎癥在其中扮演著重要角色。整合素(integrin)是細(xì)胞表面粘附分子中的一大家族，是一類細(xì)胞膜表面糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的相互識(shí)別與粘附，并參與細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)［1-2］、創(chuàng)傷愈合等過(guò)程［3-4］。為研究整合素在牙移動(dòng)動(dòng)物模型慢性痛中的作用及作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)、腦干三叉神經(jīng)脊束核、大腦皮層中的Integrin－αm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)Integrin－αm在慢性痛中的作用及其可能性進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 成年雄性SD大鼠60只，體重為180～220 g，清潔級(jí)，由菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育完全、體格健壯，牙齒大小適中、牙齦情況良好。于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境一周，自由進(jìn)食、飲水;室溫控制在23±2℃，自然光照。采用隨機(jī)分組方法將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組(n=30)和對(duì)照組(即術(shù)后0h組，n=30)。根據(jù)加力持續(xù)時(shí)間再隨機(jī)分為術(shù)后 1d、2d、3d、4d、5d 亞組(n=6);對(duì)照組大鼠不做任何干預(yù)。分組見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組(只)

1.2 儀器與試劑 亞鵬牌CS－IV型攤片烤片機(jī)，由孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司生產(chǎn);Leica RM2015石蠟切片機(jī)由德國(guó)徠卡公司制造;光學(xué)顯微鏡;O-lympus兔抗大鼠integrin－αm多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供;即用型SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供;DAB染液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 牙齒移動(dòng)動(dòng)物模型的制備 實(shí)驗(yàn)組將鎳鈦螺旋彈簧置于大鼠右側(cè)上頜第一磨牙與上切牙之間，用直徑為0.25 mm的不銹鋼結(jié)扎絲將彈簧的一端結(jié)扎于磨牙頸部，另一端結(jié)扎于兩個(gè)切牙上，并用優(yōu)質(zhì)雙重固化粘結(jié)劑固定，使彈簧拉伸，力量控制為50 g，這樣磨牙受到近中方向的拉力，以切牙作支抗，形成大鼠磨牙近中移動(dòng)的動(dòng)物模型［5-8］。嚴(yán)密監(jiān)控大鼠矯治器，若有損壞或脫落，及時(shí)更換安裝。加力裝置如圖1。

圖1 大鼠牙移動(dòng)示意圖

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1)石蠟切片的制備:各組大鼠各6只在給定時(shí)間點(diǎn)斷頭，分別取出雙側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)，腦干和大腦組織，置于4%甲醛溶液后固定2 h，蒸餾水浸泡10 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。自視交叉后方開(kāi)始連續(xù)冠狀位切片，厚度6 μm，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上，4℃保存?zhèn)溆谩?)免疫組織化學(xué)方法(SABC法):integrin－αm多克隆抗體，即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB染液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)染色步驟操作。光鏡下觀察胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照切片不加一抗，用0.01 mol/L PBS代替，不出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。每只大鼠取4張連續(xù)切片，在200倍光鏡下觀察三叉神經(jīng)節(jié)，腦干三叉神經(jīng)脊束核和大腦皮質(zhì)區(qū)，隨機(jī)4個(gè)視野，用LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)(Leica公司)分析各個(gè)視野的光密度值(OD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較用方差分析，兩組均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 200倍光鏡下，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的三叉神經(jīng)節(jié)、腦干三叉神經(jīng)脊束核及大腦皮質(zhì)區(qū)均可檢測(cè)到Integrin－αm的表達(dá)，Integrinαm陽(yáng)性信號(hào)呈棕色顆粒，主要分布在細(xì)胞漿中，部分在細(xì)胞核中。對(duì)照組Integrin－αm的表達(dá)極其微弱，隨著牙齒受力移動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組Integrinαm的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，無(wú)論三叉神經(jīng)節(jié)、腦干三叉神經(jīng)脊束核，還是大腦皮質(zhì)區(qū)，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，染色加深。(圖 2，3，4)。

圖2 三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Integrin－αm的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，免疫組化染色 ×200(實(shí)驗(yàn) 0d，1d，2d，3d，4d，5d)

圖3 腦干三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)Integrin－αm的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，免疫組化染色 ×200(實(shí)驗(yàn) 0d，1d，2d，3d，4d，5d)

圖4 大腦皮層內(nèi)Integrin－αm的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，免疫組化染色 ×200(實(shí)驗(yàn) 0d，1d，2d，3d，4d，5d)

2.2 圖像分析 200倍光鏡下，在對(duì)照組的三叉神經(jīng)節(jié)、腦干三叉神經(jīng)脊束核及大腦皮質(zhì)區(qū)均可檢測(cè)到Integrin－αm的微弱表達(dá)，其OD值較低，三個(gè)區(qū)域相比沒(méi)有顯著差別(P ＞0.05，表2，3，4)。Integrin－αm陽(yáng)性信號(hào)呈棕色顆粒，主要分布在細(xì)胞漿中，部分在細(xì)胞核中有表達(dá)。正畸治療加力能誘導(dǎo)Integrin－αm的表達(dá)增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(1d～5d)，實(shí)驗(yàn)組Integrin－αm的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，無(wú)論三叉神經(jīng)節(jié)、腦干三叉神經(jīng)脊束核，還是大腦皮質(zhì)區(qū)，其OD值均隨之明顯升高，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

表2 三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組免疫組化染色平均光密度值(x±s)

表3 腦干三叉神經(jīng)脊束核內(nèi)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組免疫組化染色平均光密度值(x±s)

表4 大腦皮層內(nèi)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組免疫組化染色平均光密度值(x±s)

3 討論

正畸臨床治療是通過(guò)對(duì)錯(cuò)位的牙，牙弓或合頁(yè)骨施加一定的矯治力來(lái)達(dá)到矯治畸形的目的，伴隨著很多機(jī)體的反應(yīng)，疼痛的產(chǎn)生是正畸治療中最常見(jiàn)的問(wèn)題之一，也是正畸工作急需解決的問(wèn)題。因此疼痛一直是學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn).炎癥是組織對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)中扮演著重要的作用。1987年Hynes［9］首先報(bào)道:整合素是一類跨膜糖蛋白，由α與β兩個(gè)亞單位在細(xì)胞表面經(jīng)非共價(jià)鍵形式連接而成。整合素(integrins)是介導(dǎo)破骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)識(shí)別與黏附的重要因子，直接影響牙齒移動(dòng)［10］。

正常情況下整合素?zé)o活性，在激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)等刺激下其構(gòu)型及親和力發(fā)生改變而具活性。活化的整合素有多種功能，主要是黏附和信號(hào)傳導(dǎo)兩大功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、增殖、趨化、遷移、凋亡。其胞外區(qū)通過(guò)識(shí)別配體而介導(dǎo)細(xì)胞黏附于ECM;胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞骨架蛋白形成形態(tài)學(xué)上的黏著斑，并與細(xì)胞骨架相連，形成配體－整合素－細(xì)胞骨架跨膜信息系統(tǒng)，從而將ECM與細(xì)胞骨架連接起來(lái)介導(dǎo)雙向信號(hào)傳導(dǎo)。

正畸牙齒的移動(dòng)依賴于牙周組織的改建過(guò)程，其中牙槽骨的改建尤為重要。牙槽骨的改建是受眾多因素影響的極復(fù)雜過(guò)程，局部生長(zhǎng)因子如VEGF、TGF－β、bFGF等的作用已經(jīng)十分肯定。目前研究認(rèn)為在牙周炎癥的破壞機(jī)制中，整合素發(fā)揮了重要作用。參與牙周組織改建的主要功能細(xì)胞有:破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。目前在破骨細(xì)胞上鑒定出的整合素主要有 αvβ3、α2β1和 αvβ13 種，可介導(dǎo)破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)蛋白(骨橋蛋白、骨唾液酸蛋白和纖連蛋白)的黏附，促進(jìn)其分化和成熟，活化其骨吸收功能。在靠近骨質(zhì)表面破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜分化成兩個(gè)區(qū)，共同構(gòu)成骨吸收裝置，此裝置的形成也有賴于整合素與特異骨基質(zhì)蛋白間的相互作用。Talic等［11］發(fā)現(xiàn)正畸牙移動(dòng)過(guò)程中整合素αvβ3在破骨細(xì)胞表面大量表達(dá)，促進(jìn)骨吸收作用。正常人成骨細(xì)胞上的整合素有 α3β1、α4β1、α5β1和 αvβ3。Schneider等［12］通過(guò)添加α5或β1的抗體使成骨細(xì)胞礦化反應(yīng)減少20% ～45%，添加αvβ3的抗體成骨細(xì)胞礦化反應(yīng)約減少65%，拮抗α3β1成骨細(xì)胞礦化反應(yīng)減少近95%，這說(shuō)明整合素調(diào)節(jié)的黏附和信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)了成骨細(xì)胞的漸進(jìn)分化，及其與礦化基質(zhì)的黏附。成纖維細(xì)胞是牙周膜中的主要功能細(xì)胞，其與ECM的黏附是牙周組織再生及創(chuàng)傷修復(fù)的重要過(guò)程。牙周膜和牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá) α2、α5、β1、αvβ3，對(duì)介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的黏附、分化和成熟是十分必要的［13］。體外實(shí)驗(yàn)拮抗β1能明顯抑制牙周膜和牙齦成纖維細(xì)胞黏附到釉基質(zhì)蛋白上，可見(jiàn)整合素參與了釉基質(zhì)蛋白和牙周膜及牙齦成纖維細(xì)胞的相互作用［14，15］?？梢?jiàn)整合素在牙周組織改建中具有調(diào)節(jié)激活各種牙周細(xì)胞，促進(jìn)牙周組織改建的功能。

研究結(jié)果表明，在對(duì)照組的三叉神經(jīng)節(jié)、腦干三叉神經(jīng)脊束核及大腦皮質(zhì)區(qū)均可檢測(cè)到Integrinαm的微弱表達(dá)，其OD值較低，三個(gè)區(qū)域相比沒(méi)有顯著差別。正畸創(chuàng)傷能誘導(dǎo)Integrin－αm的表達(dá)增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(1d～5d)，實(shí)驗(yàn)組Integrin－αm的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明 Integrin－αm 參與了錯(cuò)牙合矯正術(shù)后炎癥過(guò)程，這一過(guò)程不僅僅與牙周組織的激活和改建有關(guān)，更重要的是引起上級(jí)神經(jīng)元(腦干三叉脊髓束核乃至大腦皮層相應(yīng)區(qū))及傳導(dǎo)通路的功能發(fā)生改變。在以往對(duì)人正畸牙移動(dòng)疼痛的研究中發(fā)現(xiàn)，3.4%的患者在放置弓絲后立即有牙痛，少數(shù)在2～3 d才出現(xiàn)癥狀，疼痛一般持續(xù)5～7 d，其中在加力2～3 d后疼痛最嚴(yán)重，這與本實(shí)驗(yàn)得出的Integrin－αm陽(yáng)性表達(dá)變化相似。因此，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可在一定程度上反應(yīng)人正畸牙移動(dòng)時(shí)傷害信息的傳遞過(guò)程，Integrin－αm在其中產(chǎn)生的重要作用。調(diào)節(jié)Integrin－αm的表達(dá)水平可能有助于改善錯(cuò)牙合矯正術(shù)后局部和全身炎癥反應(yīng)，也為臨床研治新型鎮(zhèn)痛藥物提供了新的靶點(diǎn)。

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