物理實驗中的顯微攝影實驗

李維暉,張 宏,陳 新

(北京理工大學(xué)物理實驗中心,北京100081)

1 引 言

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,物理實驗中的黑白攝影技術(shù)已經(jīng)逐步退出實驗教學(xué),取而代之的是數(shù)碼攝影及計算機(jī)圖像處理技術(shù),為了使學(xué)生能在實驗室系統(tǒng)地學(xué)習(xí)這些技術(shù),我們將光學(xué)顯微攝影引入了實驗室.顯微攝影在生物、醫(yī)學(xué)、材料等研究領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用,它已成為了科學(xué)家研究的另一只“眼睛”.按照國際攝影界中公認(rèn)的說法,拍攝達(dá)到10∶1～200∶1左右影像比例屬于顯微攝影的范疇.

顯微攝影一般是借助于光學(xué)顯微鏡在目鏡處配上數(shù)碼相機(jī)或攝影鏡頭,使來自物體的光線經(jīng)過物鏡和目鏡的配合后到達(dá)數(shù)碼相機(jī)或攝影鏡頭上,形成放大數(shù)倍或數(shù)百倍于原物大小的影像進(jìn)行拍攝.在顯微攝影時應(yīng)該注意一些實際操作問題,來提高拍攝效果.

2 顯微攝影前的準(zhǔn)備工作及基本步驟

顯微攝影之前需要對顯微鏡進(jìn)行攝影前的基本調(diào)節(jié),首先認(rèn)真檢查顯微鏡的物鏡、聚光鏡安裝定位是否正確,然后調(diào)節(jié)目鏡的兩眼瞳距和校正屈光度.調(diào)節(jié)方法是用1只眼通過調(diào)節(jié)攝像目鏡上的屈光調(diào)節(jié)環(huán),使目鏡視野中心的“十”字由單線變成清晰的雙線,如圖1所示.顯微攝影的基本步驟如下:

1)首先將被拍切片置于顯微鏡載物臺上,打開照明系統(tǒng).

圖1 屈光度校正

2)用較小倍率如4×或10×物鏡調(diào)準(zhǔn)焦點,目的是確定載物臺的位置.

3)再將臺下聚光鏡的孔徑光闌與視場光闌收縮到最小位置,此時視野中出現(xiàn)多邊形影像.

4)“下調(diào)焦”.用臺下聚光鏡的升降旋鈕,上下移動聚光鏡,使視場光闌的影像清晰地呈現(xiàn)在標(biāo)本平面上.

5)光學(xué)合軸.調(diào)節(jié)光學(xué)旋轉(zhuǎn)臺下聚光鏡上的2個定心旋鈕,將視場光闌的影像調(diào)整到視野中心位置處,聚光鏡的位置應(yīng)固定不動.

6)調(diào)整視場光闌和孔徑光闌.

7)調(diào)焦觀察.在照明觀察標(biāo)本時,使視野內(nèi)見不到燈絲的影像,整個視野內(nèi)亮度要非常均勻,而均勻的照明是顯微攝影時重要條件之一.

3 光學(xué)顯微鏡的用光

在使用光學(xué)顯微鏡攝影時,要注意光源的調(diào)節(jié)和色溫的變化,同時還要有明亮、均勻、無反光的照明系統(tǒng).另外,要根據(jù)樣品的性能差異,選用不同的照明方法來拍攝.

3.1 光源的選擇

在明視場照明顯微攝影時,一般選擇色溫在2 700～3 200 K之間,6 V或者12 V螺口形白熾鎢絲燈泡做照明光源,其亮度的調(diào)整由變壓器實現(xiàn),由于這種光源在照明時看上去很亮,但實際色溫并不高,所以要盡量用最高電壓,使燈光亮度、色溫提高,并使用RAW格式拍攝,以便后期校正色溫.

長期使用的白熾鎢絲燈泡,鎢絲蒸發(fā)后會在玻璃罩內(nèi)壁積聚一些沉物,會使白熾鎢絲燈泡的亮度與色溫降低,因此,光學(xué)顯微攝影的優(yōu)質(zhì)光源一般選用12 V 1 00 W燈管內(nèi)充滿鹵素氣體的鹵素鎢絲燈.在燈絲點燃后,鹵素鎢絲燈蒸發(fā)出來鎢會與鹵素氣體形成鹵化鎢,附著在燈管內(nèi)壁;而關(guān)閉電源冷卻時,鹵化鎢又會分解,鎢又回到燈絲上去,這樣就改善了光源照明,提高了光源強(qiáng)度,使燈泡的壽命延長了,同時也縮小了燈泡的幾何尺寸.

3.2 光學(xué)顯微攝影的用光方法

拍攝顯微照片時,照明方法可分為2種:透射光照明,如圖2所示,光源射出的光線從標(biāo)本的下面透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡;反射光照明(落射光照明),如圖3所示,光線從正面投射到標(biāo)本的正面,而透過物鏡接收到的光是從標(biāo)本反射來的光.

圖2 透射光照明光路

圖3 反射光照明(落射光照明)光路

透射光照明通常用于拍攝透明標(biāo)本,而落射光照明主要用于拍攝不透明的標(biāo)本,如植物果實表面、皮膚、小生物等,拍攝后的相片具有一定的立體感.在使用落射光拍攝時,光線與物鏡光軸之間的角度越小越好,現(xiàn)在的顯微鏡裝置中落射光大多與物鏡合軸.本次實驗所用顯微鏡為XSP-BM13C三目落射式熒光顯微鏡,它具有透射式和落射式照明系統(tǒng).

4 光學(xué)顯微攝影影響曝光的因素

1)由于光源電壓的波動會引起曝光量的改變,光源強(qiáng)度對曝光的影響,可能產(chǎn)生5～10倍的亮度變化,所以在攝制過程中要保持電壓的相對穩(wěn)定.

2)光源的波長及色溫對曝光會產(chǎn)生影響.光源的波長較長、色溫低,色光偏紅時,曝光時間要長些;光波較短,色溫高,色光偏青時,曝光時間要短些.

3)聚光鏡光闌孔徑的大小變化能使曝光產(chǎn)生2～20倍的變化.

4)被拍攝物質(zhì)的介質(zhì)折射率對曝光時間的影響.曝光時間與折射率成反比,如果標(biāo)本與目鏡間的介質(zhì)折射率大、曝光時間短,反之,曝光時間長.

5)濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡對曝光時間的影響.如果使用濾色片等要按其曝光指數(shù)增加曝光時間(可選用手動曝光).

6)其他因素對曝光時間的影響,如目鏡的放大率、物鏡的倍率和NA值、從目鏡出射點到感光片的距離、標(biāo)本的染色等也會對曝光產(chǎn)生一定的影響.

5 攝影中應(yīng)注意的問題

5.1 標(biāo)本的聚焦要準(zhǔn)確

顯微攝影觀察的是肉眼無法觀察的標(biāo)本,因此,觀察拍照時的調(diào)焦要非常仔細(xì),稍不留意就可能聚焦不清晰.特別是用高倍鏡觀察時由于其景深比較小,聚焦更是困難.實驗中應(yīng)該手眼配合,耐心調(diào)節(jié).

5.2 視場光闌的調(diào)節(jié)

視場光闌的主要作用是調(diào)節(jié)視場照明范圍.在顯微攝影時,如果視場光闌過大,照射到被攝物體上的光超過視場直徑,視場以外的光線經(jīng)玻璃和標(biāo)本的反射和不規(guī)則的散射,造成影像反差的減弱,降低了影像的清晰程度.反之,光闌收縮過小,其照明范圍小于視場直徑時,視野四周被遮擋,不能觀察和拍攝到全部物像.在顯微攝影時,視場光闌還應(yīng)適當(dāng)縮小,視場光闌的像比攝影范圍標(biāo)記略大即可.

5.3 孔徑光闌的調(diào)節(jié)

聚光鏡除了將光源投射來的光有效地聚焦在被檢標(biāo)本上外,還通過聚光鏡孔徑光闌的調(diào)節(jié)產(chǎn)生與物鏡相適應(yīng)的光束,使圖像的反差和景深處于最佳狀態(tài),也就是說,聚光鏡孔徑光闌具有控制拍攝標(biāo)本景深范圍的作用,這與普通照相機(jī)鏡頭中光闌的作用是相似的.因此,聚光鏡的孔徑光闌與顯微照片的反差和清晰度有直接關(guān)系.

一般的原則是當(dāng)物鏡的放大倍率增大時,聚光鏡的孔徑光闌也應(yīng)相應(yīng)增大以提高視野亮度,但這是以減小景深為代價的.在顯微攝影中,大多數(shù)被檢物體要想得到高質(zhì)量照片,聚光鏡的孔徑光闌要調(diào)節(jié)在數(shù)值孔徑的60%～80%,至于具體調(diào)節(jié)多少要根據(jù)具體圖像的反差而定,開大了照片反差降低,開小了圖像分辨率將受影響.所以有經(jīng)驗的攝影者可以一邊觀察調(diào)焦目鏡中的圖像,一邊調(diào)節(jié)孔徑光闌,直到影像的反差、景深和清晰度處于最佳狀態(tài)時為止.

5.4 合理使用濾色片

在拍攝過程中,加入濾色片對圖像的對比度、色調(diào)、飽和度等都有很大的影響.對于一個特定的觀察目標(biāo),選擇合適的濾色片對圖像的觀察具有重要意義.在顯微鏡下用肉眼觀察某一標(biāo)本時,觀察到的色彩豐富,但拍攝出來的相片色彩卻非常平淡,特別是黑白攝影.目前依然以黑白顯微攝影為主,但重要的問題是缺乏對比.為了獲得高清晰度的形態(tài)分析照片,在生物標(biāo)本的制作中為了使各種組織容易區(qū)別,大部分是用不同的化學(xué)方法進(jìn)行染色,以偽彩效果來觀察其結(jié)構(gòu)形態(tài),著重對某一顏色標(biāo)本的形態(tài)進(jìn)行分析.

濾色片在拍攝中對什么樣的標(biāo)本幾乎都是有用的.為了使照片達(dá)到突出某色圖像的效果,曝光前在光源上加上此色的補(bǔ)色濾色片即可.由于濾色片的使用使白光變?yōu)槟骋徊ㄩL的單色光,不同色光的波長其折射率有所區(qū)別,使用不同顏色的濾色片,光線經(jīng)過聚光鏡會聚的情況即有差異,聚光鏡都應(yīng)作相應(yīng)的上下調(diào)整,即應(yīng)重新調(diào)整照明系統(tǒng).除性能極好的復(fù)消色差的聚光鏡外.如使用紅色長波濾色片時聚光鏡應(yīng)適當(dāng)下降;而使用藍(lán)色短波濾色片時聚光鏡則應(yīng)酌情上升.

6 結(jié)束語

隨著實驗條件的不斷完善,可以進(jìn)一步提高顯微攝影技術(shù),通過顯微攝像觀察、拍攝微生物、細(xì)胞變化等動態(tài)過程.顯微攝影無論是在科學(xué)研究方面還是在藝術(shù)攝影方面都有著廣泛的應(yīng)用,學(xué)生經(jīng)過學(xué)習(xí)顯微攝影技術(shù),不僅可以學(xué)到相關(guān)的理論知識,掌握顯微攝影這門技術(shù),更能積累豐富的實踐經(jīng)驗,逐步提高拍攝水平.

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