HPLC測(cè)定藍(lán)萼香茶菜中齊墩果酸和熊果酸的含量

沈曉丹， 袁 杰， 徐乃玉， 李 寧， 張 健，2*

(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123;2.蘇州利元醫(yī)藥科技有限公司，江蘇蘇州215011;3.安徽省食品藥品檢定所，安徽合肥230051)

藍(lán)萼香茶菜Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxin.)Hara為唇形科香茶菜屬植物，為民間藥，性味苦、寒，具有健胃、清熱解毒、活血等功能，用于治療胃炎，脘腹脹痛，肝炎初期，感冒發(fā)熱等。藍(lán)萼香茶菜葉中主要含有藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼丙素、ent-7β，14α，15β 三羥基-16-貝殼杉烯-3-酮等二萜類(lèi)成分;木栓酮、乙酰熊果酸、齊墩果酸、熊果酸、2α-羥基熊果酸、2α，3α-二羥基熊果酸等三萜類(lèi)化合物;及槲皮素、蘆丁等黃酮;β-谷甾醇、胡蘿卜苷、果糖等其它類(lèi)化合物。張?jiān)┑炔捎梅聪郒PLC測(cè)得藍(lán)萼甲素含量為1.03%，但未對(duì)三萜類(lèi)成分-齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行含量測(cè)定［1-4］。齊墩果酸和熊果酸具有較強(qiáng)的生理活性，齊墩果酸具有保肝、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗高血壓、抗炎、抗病毒、免疫凋節(jié)、抑制血小板聚集和抗氧化等多種藥理作用;熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血糖、抑制癌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等作用［5-6］;為此，有必要建立該植物的齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量控制方法。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了同時(shí)測(cè)定藍(lán)萼香茶菜葉中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為進(jìn)一步有效控制藍(lán)萼香茶菜的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC20A高效液相色譜儀(二元梯度515泵、智能柱溫箱、紫外可見(jiàn)檢測(cè)器SPD-M20A、化學(xué)工作站等)。齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110709-200304，供含量測(cè)定用);熊果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110742-200516，供含量測(cè)定用);甲醇為色譜純;水為純化水;其余試劑均為分析純;藍(lán)萼香茶菜采自黑龍江省鐵力市桃山林業(yè)局白河林場(chǎng)(海撥 280.4m;N 46°986′;E128°688′)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為藍(lán)萼香茶菜Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxin.)Hara;標(biāo)本保存在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 -0.1%磷酸(80∶20);流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品，用甲醇超聲溶解配成含0.13 mg/mL齊墩果酸、0.78 mg/mL熊果酸的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱取葉1 g，置于250 mL園底燒瓶，加入25 mL甲醇，回流提取2 h，過(guò)濾，回收甲醇，溶解于10 mL水中，石油醚萃取兩次，每次20 mL，水層回收至干，25 mL甲醇溶解，過(guò)濾，定容至25 mL量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品溶液、樣品溶液按上述色譜條件，進(jìn)樣20 μL，測(cè)得其 HPLC圖譜，如圖1所示，齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間分別為24.6 min和26.8 min;理論塔板數(shù)分別為13 592和12 096;分離度為1.453;符合定量分析的要求。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取上述對(duì)照品混合溶液0.1、0.3、0.7、1.1、1.5 mL至 5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取上述溶液20 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得齊墩果酸線性回歸方程為Y=7 756 267 X+10 973，r=0.999 8;熊果酸線性回歸方程為Y=7 951 888X+17 163，r=0.999 5;表明當(dāng)齊墩果酸進(jìn)樣量在2.6～39.0 μg，熊果酸進(jìn)樣量在 1.6 ～23.4 μg之間時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 藍(lán)萼香茶菜HPLC圖譜

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，按上述色譜條件測(cè)定齊墩果酸和熊果酸峰面積，計(jì)算齊墩果酸峰面積的RSD為1.59%，熊果酸峰面積的RSD為1.69%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.3項(xiàng)樣品溶液制備方法處理同一樣品5份，各吸取20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，分別測(cè)定齊墩果酸和熊果酸峰面積，計(jì)算齊墩果酸峰面積的 RSD為1.52%，熊果酸峰面積的RSD為2.20%，表明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取藍(lán)萼香茶菜，依2.3項(xiàng)制備供試品溶液，在 0，2，4，8，12，24 h 各吸取 20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得齊墩果酸的峰面積RSD為1.35%，熊果酸的峰面積RSD為1.14%。實(shí)驗(yàn)表明，樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取5份已知含量的藥材各0.5 g，精密稱定。分別精密加入含齊墩果酸、熊果酸的混合對(duì)照品溶液1 mL(含齊墩果酸1.3 mg，熊果酸2.3 mg)。5份樣品按2.3項(xiàng)樣品溶液的制備方法處理，依上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品含量測(cè)定 精密稱取葉、莖各1 g，分別置于250 mL圓底燒瓶，各加入25 mL甲醇，回流提取2 h，過(guò)濾，回收甲醇，10 mL水溶解，石油醚萃取兩次，每次20 mL，水層回收至干，再用25 mL甲醇溶解，過(guò)濾，定容至25 mL量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液 。按以上色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得葉中齊墩果酸平均含量0.109 8 mg/g(n=5，RSD=1.92%)，熊果酸平均含量0.143 92 mg/g(n=5，RSD=3.04%);莖中齊墩果酸平均含量0.026 3 mg/g(n=5，RSD=1.58%)，熊果酸平均含量0.028 1mg/g(n=5，RSD=2.66%)。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 樣品液制備方法的優(yōu)化 齊墩果酸、熊果酸的提取溶劑主要有氯仿、乙醇、乙醚，提取方法有超聲法、索式提取法、回流提取法［7-8］。本實(shí)驗(yàn)用甲醇作為溶劑，采用超聲法、回流方法提取，結(jié)果表明回流法效果好，進(jìn)一步考察去除葉綠素的方法，分別考察石油醚萃取或石油醚先脫脂后提取，結(jié)果表明石油醚萃取效果好，同時(shí)，采用正交設(shè)計(jì)，對(duì)提取溶劑體積、提取次數(shù)、提取時(shí)間、石油醚萃取次數(shù)、石油醚用量進(jìn)行考察，確定最佳工藝。

3.2 齊墩果酸、熊果酸互為同分異構(gòu)體，極性相近，兩者不容易分開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)甲醇-0.1%磷酸以不同比例(75∶25、78∶22、80 ∶20)混合作為流動(dòng)相，考察其分離度，結(jié)果210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，流速1.0 mL/min，甲醇:0.1%磷酸(80∶20)，樣品中齊墩果酸、熊果酸分離較好，故本試驗(yàn)最終確定此色譜條件。

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