RP-HPLC法測定復方白斑酊中3組分的含量

侯玉華， 鄭 敏， 叢曉東， 孔 艷

(1.江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校，江蘇徐州221116;2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053;3.徐州市中醫(yī)院，江蘇 徐州221000)

白斑酊(簡稱本品，下同)是徐州市中醫(yī)院制劑室制劑(批準文號:蘇藥制字Z04001904)，由補骨脂、菟絲子、梔子等多味藥材組成，具有滋補肝腎，涼血解毒。臨床上主要用來治皮膚白斑，白癜風，斑禿等癥。原標準過于簡單，無含量測定，為提高本品的內(nèi)在質(zhì)量，增強標準的約束力，在參考其他文獻的基礎(chǔ)上［1-3］，建立反相高效液相色譜法對白斑酊中3種主要藥效成分(梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素)含量同時進行測定。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A型紫外檢測器，CTO-10A S vp型柱溫箱，CBM-102型工作站。RE-52A旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))，電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，HS6150D超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)。梔子苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)，梔子苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品批號:110749-200714，110739-200814，110738-200410，白斑酊為徐州市中醫(yī)院制劑室提供，白斑酊批號 090517、090529、100301，甲醇為色譜純(天津四友精細化學品有限公司)，乙腈(進口乙腈HPLC/spectro As1122-001)，水為哇哈哈純凈水，所用其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱SHMADZU shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm serial NO 8042464);柱溫:室溫;流動相:乙腈-水梯度洗脫，0～10 min(13:87～20:80)，10～35 min(20:80～50:50)，35～45 min(50:50)。流速:1.0 mL/min;檢測波長:238 nm;進樣量由定量環(huán)控制為20 μL;理論塔板數(shù)按梔子苷峰計算應(yīng)不低于3 000。在此條件下，梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素保留時間分別為4.3 min、28.3 mim、29.2 min，與相鄰成分達到基線分離，與其它相鄰色譜峰分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素對照品適量，加甲醇分別配制成為 0.059 6 mg/mL、0.051 9 mg/mL、0.055 4 mg/mL的對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液各10 mL、0.5 mL、0.5 mL于25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻制成梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素濃度為 0.023 8 mg/mL、0.001 04 mg/mL、0.001 10 mg/mL的對照品混合溶液，供含量測定用。

2.2.2 樣品溶液制備 精密吸取白斑酊樣品2 mL，用甲醇稀釋50倍，0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備 分別配制缺梔子、補骨脂的處方藥材，按處方及工藝要求制備陰性樣品，照供試品溶液的制備項下方法制成陰性樣品溶液。

圖1 白斑酊HPLC譜圖

2.3 線性關(guān)系、檢出限(LOD)、測定限(LOQ)考察

分別精密吸取上述對照品混合溶液1、2、3、4、5、6 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件分別進樣20 μL記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)得回歸方程為:梔子苷Y=1×10-6X+1 708.5，r=0.999 4，線性范圍0.048 0 μg ～0.286 μg。補骨脂素 Y=1 ×10-7X-1 647.1，r=0.999 4，線性范圍0.002 10 μg～0.012 5 μg。異補骨脂素 Y=6×10-6X-676，r=0.999 2，線性范圍 0.002 20 μg～0.013 3 μg。用所選擇的條件，取實際樣品稀釋后進樣，當信噪比(S/N)≥3時，檢出限(LOD):梔子苷0.03 ng，補骨脂素0.04 ng，異補骨脂素0.04 ng。當信噪比(S/N)≥10時，測定限(LOQ):梔子苷0.08 ng，補骨脂素0.08 ng，異補骨脂素0.14 ng。

2.4 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液20 μL(梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素濃度分別為11.9 μg/mL，0.520 μg/mL，0.555 μg/mL)，按上述色譜條件下，連續(xù)進樣5次，以峰面積計算RSD值，結(jié)果梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素RSD(%)分別為2.3%、0.9%、0.7%。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品制成供試品溶液，精密量取 20 μL，分別在0、1、2、4、6、8、10 h 進樣，記錄色譜峰面積，計算RSD值，結(jié)果梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素分別為:0.62%、0.59%、0.92%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測定要求。

2.6 重復性試驗 同一批樣品(批號090517)精密移取6份，分別按樣品測定方法測定，計算RSD值，結(jié)果測得梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素平均含量分別為 0.482、0.018、0.020 mg/mL，梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素RSD分別為0.21%、1.9%、2.7%。

2.7 加樣回收率試驗 精密吸取白斑酊(批號090517含量:梔子苷為0.481 mg/mL，補骨脂素為0.018 mg/mL，異補骨脂素為0.020 mg/mL)9份，每份1.0 mL，分成3組，每組3份分別精密加入含梔子苷、補骨脂素、異補骨脂素(0.023 84 mg/mL、0.001 04 mg/mL、0.001 11 mg/mL)對照品混合液各18、19、20 mL，按樣品操作方法項下制備供試品溶液，進樣20 μL測定，計算加樣回收率及RSD值，結(jié)果測得梔子苷、補骨脂素和異補骨脂素的平均回收率分別為:96.32%、97.95%、97.52%，RSD分別為1.3%、0.60%、1.2%(n=9)。見表1～3。

表1 梔子苷加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

表2 補骨脂素加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

表3 異補骨脂素加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.8 樣品測定 取3批白斑酊，按2.2項下樣品溶液制備方法操作，制成樣品溶液，取樣品溶液與對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標法計算樣品中梔子苷、補骨脂素、異補骨脂素的含量即得。結(jié)果見表4。

表4 白斑酊的含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 文獻［1］梔子苷含量測定流動相乙腈-水(11:89)等度洗脫，檢測波長238 nm，文獻［2-3］中補骨脂素、異補骨脂素含量測定流動相甲醇-水等度洗脫，檢測波長245 nm。因此在文獻的基礎(chǔ)上，取2.2.2項下樣品溶液經(jīng)反復實驗，采用乙腈-水(梯度洗脫)，3組份同時檢出，干擾組份少，各組份與相鄰成分達到基線分離，出峰時間、峰形、柱效均較為滿意，結(jié)果穩(wěn)定，且陰性對照無干擾。為確保檢測靈敏度，于不同波長下進行分析，結(jié)果在波長238 nm下三者的檢測靈敏度均較好，峰面積變化小，故本實驗選用238 nm作為檢測波長同時測定3種組份的含量。

3.2 溶劑選擇 本實驗分別采用50%乙醇，50%甲醇，100%甲醇作溶劑，50%乙醇為溶劑時，但基線往下漂移，穩(wěn)定性差，溶劑峰干擾梔子苷峰，50%甲醇、100%甲醇作溶劑樣品峰型均好，但50%甲醇過濾不易。綜合以上原因，選用100%甲醇為溶劑所得的梔子苷、補骨脂素、異補骨脂素的含量最大，效果最佳。同時檢出成分比較少，使梔子苷、補骨脂素、異補骨脂素易于檢出。

3.3 方法不足 如有條件盡可能多的得到對照品種類，在同一色譜條件下對其進行3組份以上含量測定，全面提升白斑酊質(zhì)量標準水平。

［1］蔣 渝.消腫止痛膏質(zhì)量標準研究［J］.藥物鑒定，2007，16(13):23-24.

［2］周吳萍，梁 丹，韋海園.HPLC法同時測定白癜風膠囊中2種成分含量的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(25):10745-10746.

［3］成光宇，胡 榮.高效液相色譜法測定白癜風顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量［J］.中藥現(xiàn)代化，2008，28(12):920.