陜北白絨山羊H-FABP基因內(nèi)含子3的遺傳多態(tài)性分析

余 剛

(西寧市畜牧獸醫(yī)站,青海 810003)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein,FABPs)家族是由一些小的、存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成,在機(jī)體中參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的攝取,并能協(xié)助將動(dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸從胞膜處運(yùn)至其進(jìn)行β-氧化的場(chǎng)所或甘油三酯和磷酯合成部位,促進(jìn)心肌和脂肪細(xì)胞中甘油三酯的沉積,對(duì)體脂的沉積及動(dòng)員等具有重要調(diào)控作用[1-3]。Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn),30～90日齡的公哈薩克綿羊肌肉組織中H-FABP的表達(dá)水平與肌間脂肪(intramuscular fat,IMF)含量呈極顯著的強(qiáng)正相關(guān)。目前普遍認(rèn)為FABP是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因,在肉質(zhì)性狀的形成中具有重要的生物學(xué)功能,因此將H-FABP基因作為候選基因來(lái)研究其與動(dòng)物生產(chǎn)性狀的關(guān)系,對(duì)動(dòng)物分子育種和標(biāo)記輔助選擇具有一定的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

陜北白絨山羊?yàn)橹慕q肉兼用型培育山羊品種,除產(chǎn)絨性能優(yōu)良外還具有肉質(zhì)細(xì)嫩、肉中膽固醇含量少、膻味輕等特點(diǎn),但由于體型稍小,其產(chǎn)肉性能有待提高。本研究通過(guò)分析陜北白絨山羊H-FABP基因的SNPs及其對(duì)生長(zhǎng)和胴體性狀的影響,探討陜北白絨山羊群體的遺傳特性,為陜北白絨山羊的選育提高和分子標(biāo)記輔助選擇等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及基因組DNA的提取 從陜西省橫山縣狄青原陜北白絨山羊原種場(chǎng)隨機(jī)抽取原種周歲陜北白絨山羊253只,頸靜脈采血,ACD抗凝,并參照文獻(xiàn)[5]的方法,提取血液基因組DNA。

1.2 胴體和體尺指標(biāo)測(cè)定 周歲陜北白絨山羊眼肌面積和背膘厚的測(cè)定參考Silva等[6]的方法,應(yīng)用加拿大AMI-900型便攜式獸用B超儀測(cè)定。實(shí)驗(yàn)羊體重及主要體尺指標(biāo)參考張沅等[7]的方法,由同一人實(shí)地測(cè)量,并記錄被測(cè)個(gè)體的出生重和5月齡斷奶重。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR反應(yīng)擴(kuò)增 參照綿羊 HFABP基因的序列(ACCESSION AY157617)設(shè)計(jì)引物,序列如下:

Forward:5'-AGCCTTCGT TTCATCCTC-3'

Reverse:5'-AGCAAGTAT TTGGTCCTGT-3'

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系25 μ L:Taq DNA Polymerase(MBI產(chǎn),0.5 u/μ L)2.0 μ L,2.5 mmol/L MgCl22.0 μ L,10 ×Buffer 2.5 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μ L,50 ～ 100 ng 模板 DNA,10 pmol/μ L 上下游引物各 0.4 μ L,加水至25 μ L。PCR反應(yīng)程序:95℃5 min;94℃40 s,48.9℃50 s,72℃1 min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析 利用垂直凝膠電泳法進(jìn)行PCR-SSCP分析。將5 μ L的 PCR產(chǎn)物加入5 μ L的上樣緩沖液(Loading Buffer)中 98℃變性 10 min,立即冰浴10 min后點(diǎn)樣于預(yù)冷的10%聚丙烯酰胺凝膠中,以5 V/cm電壓于20℃的1×TBE電泳液中電泳12～14 h,最后銀染照相。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收測(cè)序 經(jīng)SSCP分析后不同基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用柱式膠回收試劑盒(購(gòu)自杭州博日科技有限公司)回收純化,回收后的DNA片段送交上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)該位點(diǎn)基因型的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗(yàn),依據(jù)最小二乘分析原理,用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的一般線性模型GLM程序?qū)θ后w H-FABP基因型效應(yīng)進(jìn)行分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。依據(jù)影響生長(zhǎng)和胴體性狀的因素,并考慮本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況(所有參試周歲羊均采用半舍飼半放牧的飼養(yǎng)管理方式并在相同條件下飼養(yǎng)),引入下列參數(shù)并建立以下模型:

Yij=μ+Gi+Sj+Gi×Sj+Eij

式中Yij為性狀表型值,μ為群體平均值,Gi為基因型效應(yīng),Sj為性別效應(yīng),Gi×Sj是基因型與性別之間的互作效應(yīng),Eij為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)所得到的超聲波掃描切面影像圖的灰度、對(duì)比度、增益度等較適宜,圖像清晰,且測(cè)量部位受體位變化影響小,代表性強(qiáng),易于定位和操作,故根據(jù)所測(cè)超聲波影像計(jì)算的背膘厚度和眼肌面積接近真值。

2.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增片段與目的片段大小一致(526 bp),且目的條帶清晰、特異性好,可直接用于SSCP分析(圖1)。

圖1 陜北白絨山羊H-FABP基因PCR產(chǎn)物

圖2 陜北白絨山羊H-FABP基因SSCP電泳結(jié)果

圖3 陜北白絨山羊H-FABP基因2種基因型序列分析

2.3 SSCP分析 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有一對(duì)等位基因“A和B”以及兩種基因型“AA、AB”,尚未檢測(cè)到BB型個(gè)體,如圖2所示。

2.4 不同基因型個(gè)體的測(cè)序 以SSCP檢測(cè)的2種基因型AA、AB型為樣本,分別測(cè)序(如圖3)。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)在H-FABP基因位點(diǎn)存在一處突變,為G→C,因該位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū),故不引起氨基酸序列改變。

2.5 H-FABP基因多態(tài)位點(diǎn)的遺傳分析 由表1可以看出,在所研究的群體中,AA型為優(yōu)勢(shì)基因型,A等位基因在群體中為優(yōu)勢(shì)基因,B等位基因頻率較低,兩者差異顯著(P＜0.05),群體處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)。

表1 陜北白絨山羊H-FABP基因SSCP的基因頻率和基因型頻率

由表2可看出,其PIC值為0.084 4＜0.25可知,說(shuō)明該位點(diǎn)為低度多態(tài)性,表明該基因此位點(diǎn)多態(tài)性較差。

表2 陜北白絨山羊H-FABP基因多態(tài)性分析

2.6 H-FABP基因的SNPs與生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀的相關(guān)分析 運(yùn)用兩因素互作模型,對(duì)253只周歲陜北白絨山羊不同基因型個(gè)體生長(zhǎng)及胴體性狀進(jìn)行了差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明(表3),AA型和AB型之間在陜北白絨山羊的胸圍和體高上差異顯著(P＜0.05);在其他性狀上,2種基因型間均差異不顯著(P＞0.05);除在體斜長(zhǎng)和背膘厚上表現(xiàn)AB＞AA,在其他性狀上均表現(xiàn)AA＞AB,純合基因型個(gè)體各性狀的表型值相對(duì)較高。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),性別對(duì)除出生重、體長(zhǎng)、眼肌面積和背膘厚外的其他指標(biāo)均無(wú)顯著影響,互作效應(yīng)除背膘厚外差異均不顯著。

表3 H-FABP基因位點(diǎn)不同基因型對(duì)陜北白絨山羊生長(zhǎng)及胴體性狀的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 H-FABP基因第3內(nèi)含子多態(tài)性分析 本實(shí)驗(yàn)對(duì)H-FABP基因第3內(nèi)含子的多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),周歲陜北白絨山羊群體在H-FABP基因第3內(nèi)含子座位上存在1對(duì)等位基因,其中A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因;該群體在該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài),即該群體在人工選擇、遷徙和遺傳漂變等因素作用下,該基因座處于非平衡狀態(tài)中;該群體在該位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性處于低度多態(tài)水平(其PIC＜0.25)。造成上述情況的原因,可能主要與該群體在長(zhǎng)期而系統(tǒng)的閉鎖繁育中,受高強(qiáng)度的人工選擇導(dǎo)致其高度近交,造成部分等位基因流失有關(guān)。

3.2 H-FABP基因多態(tài)性與生長(zhǎng)及胴體性狀關(guān)系的分析 有關(guān)H-FABP基因與動(dòng)物生產(chǎn)性狀之間關(guān)系的研究,在國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道。Brockmann等[8]研究認(rèn)為豬第4號(hào)染色體上存在影響脂肪沉積(包括背膘厚和腹脂)以及生長(zhǎng)速度的QTL;而H-F ABP基因恰好位于豬4號(hào)染色體上,且它本身又在脂肪細(xì)胞中表達(dá)并影響甘油三酯的生成與分解[9]。Calvo等[10]采用基因組步移技術(shù)對(duì)綿羊H-FABP基因進(jìn)行了克隆并將其定位于2號(hào)染色體遺傳標(biāo)記CSRD 2115與BM 2113之間,在對(duì)4個(gè)綿羊品種(Ovis aries)和歐洲摩弗倫(Mouflon)羊的H-FABP基因外顯子2和內(nèi)含子3的研究中各發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNPs位點(diǎn)。本研究結(jié)果新發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊H-FABP基因在內(nèi)含子3內(nèi)存在G→C的突變,盡管該突變未引起氨基酸的改變,但這可能是造成了2種基因型的陜北白絨山羊在部分生長(zhǎng)及胴體性狀上存在差異的原因。從本研究結(jié)果來(lái)看,HFABP基因AA型和AB型之間在陜北白絨山羊的胸圍和體高上差異顯著(P＜0.05),且除在體斜長(zhǎng)和背膘厚上表現(xiàn)AB＞AA外,在其他性狀上均表現(xiàn)AA＞AB,這說(shuō)明H-FABP基因與絨山羊生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀相關(guān),AA型個(gè)體為有利基因型,這可能與AA型個(gè)體的H-FABP具有較高的利用脂肪的能力有關(guān),還可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)樣本數(shù)有限以及AB型個(gè)體樣本數(shù)太少所致。H-FABP基因內(nèi)含子區(qū)的變異可能影響到H-FABP的活性及基因表達(dá),調(diào)控機(jī)體脂肪代謝,進(jìn)而影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀,因此H-FABP可能是影響絨山羊脂肪代謝等的主效基因或與主效基因相連鎖,并且可能是通過(guò)MAS(標(biāo)記輔助選擇)進(jìn)行部分生長(zhǎng)發(fā)育性狀等改良的理想基因。本研究結(jié)果還顯示 ,通過(guò)提高AA型的頻率可望增加絨山羊的胸圍和體高且可能改善絨山羊的生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀,不過(guò),這需在更多群體中檢驗(yàn)G→C突變位點(diǎn)能否用于山羊相關(guān)性狀等的分子標(biāo)記輔助選擇。本文僅初步分析了不同H-FABP基因型與陜北白絨山羊相關(guān)性狀的關(guān)系,H-FABP基因是否確實(shí)影響絨山羊的生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀,是否與山羊肉IMF含量、嫩度、風(fēng)味等肉質(zhì)性狀相關(guān),還有待進(jìn)一步研究。

[1]Vander Horst D J,vanDoorn J M,Passier P C,et al.Role of fatty acid-binding protein in lipid metabolism of insect flight muscle[J].Molecular and Cellular Biochemistry,1993,123:145-152.

[2]Fischer H,Gustafsson T,Sundberg C J,et al.Fatty acid binding protein 4 in human skeletal muscle[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,346:125-130.

[3]Richieri G V,Low P J,Ogata R T,et al.Thermodynamics of fatty acid binding to engineered mutants of the adipocyte and intestinal fatty acid-binding proteins[J].The Journal of Biological Chemistry,1998,273(13):7397-7405.

[4]Huang Z G,Xiong L,Liu Z S,et al.T he developmental changes and effect on IM F content of H-FABP and PPARγmRNA expression in sheep muscle[J].Acta Cenetica Sinica,2006,33(6):507-514.

[5]薩姆布魯克J,拉塞爾DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂等譯.3版.北京:科學(xué)出版社,2002:483-485.

[6]Silva S R,Gomes M J,Dias-da-Silva A,et al.Estimation in vivo of the body and carcass chemical composition of growing lambs by real-time ultrasonography[J].Journal of Animal Science,2005,83:350-357.

[7]張沅.家畜育種學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:99.

[8]Brockmann G,Timtchenko D,Das P,et al.Detection of Q TL for body weight and body fat content in mice using genetic markers[J].Journal of Animal Breeding and Genetics,1996,113:373-379.

[9]Chmurzynska A.T he multigene family of fatty acid-binding proteins(FABPs):Function,structure and polymorphism[J].Journal of Applied Genetics,2006,47(1):39-48.

[10]Calvo J H,Vaiman D,Saidi-Mehtar N,et al.Characterization,genetic variation and chromosomal assignment to sheep chromosome 2 of the ovine heart fatty acid-binding protein gene(FABP3)[J].Cytogenetic and Genome Research,2002,98:270-273.