TopoⅡ、P170、GST-pi蛋白在胃癌中表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系

張 帆，于曉棠，孫 闖 ，陳 鑫，楊興無

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 普外科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)與法醫(yī)學(xué)教研室,遼寧 大連 116044；3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，放射線科,遼寧 大連 116027)

胃癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。影響胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的因素很多。多藥耐藥基因產(chǎn)物與腫瘤的關(guān)系最近備受關(guān)注。本文收集了2005年4月～2007年4月具完整臨床、病理及隨訪資料的大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院手術(shù)胃癌病例160例，分析耐藥基因P-糖蛋白(p-170 glycoprotein,P170)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(DNA topoisomerases,type II,TopoⅡ)、谷胱苷肽-S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase pi,GST-pi)與臨床病理特征的關(guān)系，并分析此3項(xiàng)指標(biāo)及臨床病理特征與胃癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2005年4月～2007年4月間胃癌手術(shù)病例168例，失訪5例，3例非癌癥死亡，具有完整臨床、病理及隨訪資料的共160例，具體情況見表1。所有患者在術(shù)前均未接受化療及其他針對腫瘤的治療。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

所有標(biāo)本取材后經(jīng)4%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm的石蠟連續(xù)切片，TopoⅡ、P170、GST-pi試劑盒購自福州邁新公司，操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，隨機(jī)觀察5個(gè)不同的高倍鏡視野，各計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞>10%為陽性，否則為陰性。P170、GST-pi判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)<25%為(+)，陽性細(xì)胞數(shù)25%～75%為(++)，陽性細(xì)胞數(shù)>75%為(+++)。TopoⅡ評判標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)<25%為Ⅰ級，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%為Ⅱ級，陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%為Ⅲ級，陽性細(xì)胞數(shù)>75%為Ⅳ級。

1.4 隨訪方法

生存時(shí)間以手術(shù)日起至末次隨訪時(shí)間為準(zhǔn)。通過電話、書信和門診隨訪，隨訪截止時(shí)間2008年5月1日。其中失訪5例，隨訪率為96.97%，隨訪時(shí)間最長36個(gè)月，最短1個(gè)月，平均18.09個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney test 和 Kruskal-Wallis test)分析P170、GST-pi表達(dá)與臨床病理的關(guān)系，χ2檢驗(yàn)分析Topo Ⅱ表達(dá)與臨床病理的關(guān)系，Spearman法分析Topo Ⅱ、 P170、GST-pi各因子表達(dá)之間的關(guān)系，Life table法檢測各臨床病理資料及Topo Ⅱ、P170、GST-pi與1年、2年、3年生存率的關(guān)系，Log-rank法對各因素與生存時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行單因素分析；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，并對有預(yù)后意義的指標(biāo)做出Kalplan-Meier生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Topo-Ⅱ、P170、GST-pi在胃癌組織中的表達(dá)

TopoⅡ?yàn)楹岁栃?，P170為膜陽性或胞質(zhì)和胞膜同時(shí)陽性，GST-pi為胞質(zhì)或胞核陽性，見圖1。

2.2 TopoⅡ、P170、GST-pi在胃癌中表達(dá)的關(guān)系

用Spearman法檢驗(yàn)160例胃癌中TopoⅡ、P170、GST-pi表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示P170、GST-pi二者表達(dá)呈正相關(guān)，r=0.231，P=0.003。

圖1 P170、GST-pi、Topo-Ⅱ在胃癌組織中的表達(dá)Fig 1 The expression of P170、GST-pi、Topo-Ⅱin gastric carcinomaA:GST-pi為胞質(zhì)或胞核陽性 ×200；B:P170為膜陽性或胞質(zhì)和胞膜同時(shí)陽性 ×400；C:TopoⅡ?yàn)楹岁栃?×100

2.3 TopoⅡ、P170、GST-pi的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TopoⅡ、P170、GST-pi的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系詳見表1。結(jié)果顯示P170在直徑≥5 cm的腫瘤中表達(dá)高于<5 cm的腫瘤(P<0.01)，其表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)；GST-pi在中高分化腺癌中的表達(dá)與低分化腺癌比較差異無顯著性意義，但在印戒細(xì)胞癌及粘液腺癌中的表達(dá)明顯低于前兩組(P<0.05)；低分化胃癌中TopoⅡ的表達(dá)要低于中高分化胃癌(P<0.05)，但印戒細(xì)胞癌組與前兩組比較差異不具顯著性意義。隨著腫瘤侵襲深度增加，TopoⅡ的表達(dá)亦增加(P<0.05)；胃癌伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者TopoⅡ、P170、GST-pi明顯升高(P<0.05)，其中尤以TopoⅡ的關(guān)系最為緊密(P<0.01)；TNM分期越晚， TopoⅡ、P170、GST-pi表達(dá)越高(P<0.05)。

2.4 胃癌臨床病理特征、TopoⅡ、P170、GST-pi的表達(dá)與生存時(shí)間的單因素分析及多因素分析

160例胃癌的臨床病理特征及TopoⅡ、P170、GST-pi與生存率的關(guān)系詳見表2。結(jié)果顯示單因素分析中，患者年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、病理分級、侵襲深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、TopoⅡ、P170、GST-pi均與預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。但對整個(gè)樣本所有因素進(jìn)行Cox風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析見表3。結(jié)果表明腫瘤部位、病理分級、侵襲深度、淋巴轉(zhuǎn)移、GST-pi是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。GST-pi低表達(dá)組生存時(shí)間明顯長于中高表達(dá)組。GST-pi的Kalplan-Meier生存曲線見圖2。

3 討 論

腫瘤的多藥耐藥這一概念已經(jīng)被廣泛接受，傳統(tǒng)的耐藥因子包括P-170 、TopoⅡ、GST-pi等，這些因子可以使腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同的多種抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥[1]。這些因子除了通過影響化療來影響腫瘤的預(yù)后，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)化療的胃癌組織中，它們的表達(dá)與胃癌的一些重要的臨床病理特征有關(guān)，部分因子是影響腫瘤預(yù)后的重要因素。

P170是mdr-1基因的蛋白產(chǎn)物，是一種ATP依賴的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它可在細(xì)胞膜上形成單一藥物通道，將許多化療藥物通過這種“藥泵”功能泵出細(xì)胞[2]。它還可延遲凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，從而使細(xì)胞免于多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]。本研究顯示P170的表達(dá)與胃癌的大小、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)。但P170不是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。表明在未接受化療的胃癌中，P170高表達(dá)的胃癌侵襲性及轉(zhuǎn)移力較高。這可能與P170可以抑制凋亡有關(guān)[4]。關(guān)于P170與胃癌的臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)論不一。有研究表明，P170表達(dá)水平越高，侵襲性越高，預(yù)后越差[4,5]。但也有相反意見，Lacueva[6]發(fā)現(xiàn)在胃癌中，P170與腫瘤的病理類型、分期分級及血管浸潤無關(guān)。

GST-pi是GSTs家族的一員，GSTs是一組具有解毒功能的同工酶[7]。除了催化作用，GST-pi還是一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白，還可通過調(diào)節(jié)MAP途徑影響細(xì)胞的生存和死亡[8,9]。研究表明GST-pi可催化GSH與化療藥物結(jié)合，阻止藥物攻擊腫瘤細(xì)胞，參與耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，GST-pi在低分化腺癌中的表達(dá)明顯高于中、高分化腺癌，發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM的Ⅲ期和Ⅳ期的胃癌組織中GST-pi的表達(dá)更高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)印戒細(xì)胞癌及未分化癌中的表達(dá)要低于其他腺癌，但病例比較少，還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GST-pi是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，生存曲線上，GST-pi陰性或低表達(dá)的患者預(yù)后明顯好于中高表達(dá)組。但是高表達(dá)組的預(yù)后要好于中表達(dá)組，這可能是因?yàn)楸狙芯恐懈弑磉_(dá)組病例少，存在偏差的原因。有人認(rèn)為GST-pi是一種胃腸道惡性腫瘤的標(biāo)志蛋白[10]。在上消化道中，接觸致癌因素后，機(jī)體常通過提高GST-pi水平來降低損害[11]。歐希龍等[12]在對結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)GST-pi在腫瘤中高表達(dá)，且與部分臨床病理指標(biāo)及預(yù)后密切相關(guān)。

表1 P170、GST-pi、Topo-Ⅱ與胃癌臨床病理的關(guān)系Tab 1 Correlation between the expressions of P170,GST-pi and Topo-Ⅱand clinicopathologic parameters

表2 胃癌臨床病理特征、免疫組化指標(biāo)與生存時(shí)間相關(guān)性分析Tab 2 Correlation between clinicopathologic features,expression of TopoⅡ,P170,GST-pi and survival time in gastric carcinoma

表3 Cox風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析影響胃癌預(yù)后因素Tab 3 Multibariate Cox regression analysis of prognostic factors in gastric carcinoma

1)：部位是分類資料，設(shè)定部位3(幽門及胃竇)為基準(zhǔn)，1(賁門及胃底)，2(胃體，包括2個(gè)全胃病例)

圖2 胃癌中GST-pi蛋白表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系Fig 2 Relationship between the strength of GST-pi expression and survival time1：(-)及(+)；2：(++)；3：(+++)

TopoⅡ是一種能調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶，參與基因重組、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)等。在正常細(xì)胞分裂過程中，TopoⅡ在S期和G2/M期迅速上揚(yáng)，有絲分裂結(jié)束后恢復(fù)正常水平。在腫瘤中，該酶是一些化療藥物的靶蛋白，如該酶數(shù)量減少或活性降低可導(dǎo)致以其為靶點(diǎn)的藥物誘導(dǎo)的DNA穩(wěn)定斷裂復(fù)合物形成減少，與多藥耐藥關(guān)系密切[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)TopoⅡ表達(dá)水平高的腫瘤侵襲深度深、更易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，TNM的Ⅲ期和Ⅳ期的胃癌往往存在TopoⅡ高表達(dá)(P<0.05)。在腫瘤中TopoⅡ表達(dá)水平升高，其表達(dá)水平一定程度反應(yīng)了腫瘤細(xì)胞的增殖水平[13,14]，增殖活躍的腫瘤可能更易侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。在肝癌細(xì)胞中的一項(xiàng)研究表明，TopoⅡ的高表達(dá)，可以增加腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，從而影響預(yù)后[16]。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中P170、GST-pi二者表達(dá)顯著相關(guān)。迄今為止已經(jīng)在分泌上皮、乳腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)具有一致性[17,18]。Vlachogeorgos等[19]發(fā)現(xiàn)在肺非小細(xì)胞癌中，P170、GST-pi的表達(dá)具有一致性，且二者高表達(dá)的病人往往對化療藥具有抗藥性且預(yù)后不良。所以,胃癌中對P170、GST-pi二者的綜合分析也許比單因子分析更有助于對患者的評估及治療。

胃癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多階段的綜合結(jié)果，預(yù)后與腫瘤大小、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、治療情況及分子生物學(xué)特性等多因素有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與多藥耐藥直接相關(guān)的蛋白P170 、TopoⅡ及GST-pi均參與了胃癌的發(fā)生與發(fā)展。對這些因素的研究，有利于提高胃癌的診斷及治療水平，進(jìn)一步明確多藥耐藥的原因，有利于探索克服多藥耐藥現(xiàn)象的方法，最終使患者受益。

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