β-catenin和DKK-1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)及意義

張麗潔，王莉芬，王艷華

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116023)

子宮內(nèi)膜癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。它是一種發(fā)生在子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，以子宮內(nèi)膜樣腺癌最為常見(jiàn)，是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。近年來(lái)發(fā)病有逐步上升的趨勢(shì)。目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。因此,研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子途徑,尋找以分子為靶點(diǎn)的治療途徑成為焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞中某些信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程失控有關(guān)。近年來(lái)在研究子宮內(nèi)膜周期性變化、子宮內(nèi)膜增生和癌變的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)β-catenin[2-5]和DKK-1[6-8]與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但是僅見(jiàn)少數(shù)報(bào)道，且結(jié)果不一致。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)對(duì)β-catenin和DKK-1在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜單純性增生和正常增生期子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平的檢測(cè)，探討它們?cè)谧訉m內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生過(guò)程中的可能的作用和相關(guān)性，為從分子水平研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制，探討預(yù)防、診斷、治療的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材 料

隨機(jī)選取大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科2003年1月～2009年3月病理確診為子宮內(nèi)膜樣腺癌的組織蠟塊30例作為實(shí)驗(yàn)組，患者年齡35～66歲，平均55歲。以2002年1月～2009年3月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院因子宮肌瘤手術(shù)切除的17例正常增生期子宮內(nèi)膜組織蠟塊(A組，年齡30～48歲，平均39歲，平素基本月經(jīng)規(guī)律，組織學(xué)檢查未見(jiàn)異常)以及病理確診的單純性增生子宮內(nèi)膜組織蠟塊20例(B組，患者年齡35～55歲，平均44歲)為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的30例設(shè)為C組。各組均術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未用過(guò)激素類藥物和放化療，無(wú)其他婦科合并癥。

1.2 方 法

采用免疫組化MaxVisionTM法，操作步驟按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)高溫高壓抗原修復(fù)β-catenin和DKK-1， 0.3% H2O2室溫10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，羊血清封閉液室溫10 min，加一抗(β-catenin兔抗人多克隆抗體:克隆號(hào)：sc-7199,為美國(guó)Santa Cruz產(chǎn)品，1∶400稀釋。DKK-1鼠抗人單克隆抗體:H00022943-M08,購(gòu)于臺(tái)灣abnova 公司，1∶250稀釋)，37℃水浴箱中80 min，滴加MaxVisionTM快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，置于37℃水浴恒溫箱孵育20 min。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

β-catenin及DKK-1陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。采用半定量積分法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判斷：隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分?jǐn)?shù)：0%～5%計(jì)0分；6%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；76%～100%計(jì)4分；染色強(qiáng)度：無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度兩種計(jì)分的乘積作為毎例標(biāo)本的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 β-catenin和DKK-1蛋白的表達(dá)

β-catenin和DKK-1蛋白在正常增生期子宮內(nèi)膜(A組)、子宮內(nèi)膜單純性增生(B組)和子宮內(nèi)膜樣腺癌(C組)中均有表達(dá),主要位于腺上皮細(xì)胞和腺癌細(xì)胞，與增生期子宮內(nèi)膜腺上皮相比,子宮內(nèi)膜單純?cè)錾妥訉m內(nèi)膜樣腺癌的表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1～6 。

表1 β-catenin和DKK-1在不同子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況Tab 1 Expression of β-catenin and DKK-1 in different endometrium

1)與A組比較，P<0.05；2)與A、B組比較，P<0.05

2.2 β-catenin和DKK-1在不同子宮內(nèi)膜中的相關(guān)性分析

17例正常增生期子宮內(nèi)膜(A組)、20例單純性增生子宮內(nèi)膜(B組)中β-catenin和DKK-1兩種蛋白之間不存在相關(guān)性，P>0.05；30例子宮內(nèi)膜樣腺癌(C組)中β-catenin與DKK-1的表達(dá)呈正相關(guān)，P<0.05。見(jiàn)表2。

圖1 正常增生期子宮內(nèi)膜β-catenin的表達(dá) ×100 MaxVisionTMFig 1 Expression of β-catenin in normal proliferative phase endometrium ×100 MaxVisionTM

圖2 單純性子宮內(nèi)膜增生β-catenin的表達(dá) ×100 MaxVisionTMFig 2 Expression of β-catenin in simple endometrial hyperplasia ×100 MaxVisionTM

圖3 子宮內(nèi)膜樣腺癌β-catenin的表達(dá) ×100 MaxVisionTMFig 3 Expression of β-catenin in endometrial adenocarcinoma ×100 MaxVisionTM

圖4 正常增生期子宮內(nèi)膜DKK-1的表達(dá) ×100 MaxVisionTMFig 4 Expression of DKK-1 in normal proliferative phase endometrium ×100 MaxVisionTM

圖5 單純性子宮內(nèi)膜增生DKK-1的表達(dá) ×100 MaxVisionTMFig 5 Expression of DKK-1 in simple endometrial hyperplasia ×100 MaxVisionTM

圖6 子宮內(nèi)膜樣腺癌DKK-1的表達(dá) ×100 MaxVisionTMFig 6 Expression of DKK-1 in endometrial adenocarcinoma ×100 MaxVisionTM

表2 β-catenin、DKK-1在不同子宮內(nèi)膜中之間的相關(guān)性Tab 2 Relation of β-catenin and DKK-1 in different endometrium

3 討 論

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)具有細(xì)胞間粘附連接和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)雙重功能，是一種多功能細(xì)胞內(nèi)蛋白。它參與Wnt信號(hào)通路，激活CyclinD1等癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[5,9,10]，是Wnt通路中有調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵成員[11]。在正常情況，β-catenin與E-cadherin的胞內(nèi)區(qū)形成復(fù)合體,并位于細(xì)胞膜上，參與維持上皮細(xì)胞的極性和完整性。在多種因素作用下Wnt信號(hào)異常激活，或β-catenin發(fā)生突變，細(xì)胞中β-catenin的磷酸化和降解不能正常進(jìn)行，游離的非磷酸化β-catenin在胞漿內(nèi)大量積聚后進(jìn)入核內(nèi)，激活相應(yīng)靶基因(如CyclinD1等)，引起細(xì)胞增殖和分化失控，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。周留林等[12]發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜樣腺癌β-catenin在細(xì)胞膜上的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于子宮內(nèi)膜增生癥及正常子宮內(nèi)膜,而在細(xì)胞核上的陽(yáng)性表達(dá)率增加，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)均為陰性。吳時(shí)敏[5]報(bào)道子宮內(nèi)膜樣腺癌β-catenin陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜，陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì)/胞核。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜樣腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于單純性子宮內(nèi)膜及正常增生期子宮內(nèi)膜，陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì)/細(xì)胞膜。本研究未檢測(cè)到β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，可能與抗體的來(lái)源、批號(hào)及克隆號(hào)不同有關(guān)。本研究中子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜中β-catenin陽(yáng)性表達(dá)率降低，可能是由于細(xì)胞質(zhì)中積累的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)增多，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)β-catenin表達(dá)降低；也可能由于β-catenin基因突變,產(chǎn)生具有致癌作用的突變型蛋白,而目前尚無(wú)檢測(cè)突變型β-catenin的抗體。總之，子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能受多基因、多通路調(diào)節(jié)的影響，β-catenin只是Wnt通路中的一員。Lowy等[13]檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞癌組織中β-catenin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)56%的胰腺癌β-catenin膜表達(dá)減少。因此，β-catenin在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用有待進(jìn)一步研究。

DKK-1是一種分泌蛋白，是Wnt通路強(qiáng)有力的抑制劑,其通過(guò)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、極性、遷移和癌變[6,7]。Qiao[14]報(bào)道，由于間充質(zhì)細(xì)胞分泌的DKK-1,通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路，從而抑制乳腺癌的生長(zhǎng)；DKK-1在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中是一種陰性調(diào)節(jié)劑，它能抑制Wnt通路的活動(dòng)[8]。Yi N等[15]指出DKK-1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平明顯地低于在良性子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平,外源性DKK可抑制子宮內(nèi)膜癌的侵襲。DKK-1參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和抑制其早期子宮內(nèi)膜癌侵襲,并有望作為一種生物標(biāo)志來(lái)篩選子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。Kuang[16]報(bào)道用DKK-1轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞能明顯地降低β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和E-粘連素(E-cadherin)在細(xì)胞膜上積聚，DKK-1刺激β-連環(huán)蛋白從細(xì)胞膜上的釋放并使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移。Zhu[17]的研究報(bào)道，人間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)分泌DKK-1，抑制癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)DKK-1被DKK-1抗體中和或DKK-1表達(dá)被RNA干擾下調(diào)時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的增殖的抑制效應(yīng)下降。本研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1在子宮內(nèi)膜樣腺癌的表達(dá)明顯低于正常增生期子宮內(nèi)膜及單純性增生子宮內(nèi)膜。提示DKK-1表達(dá)降低，對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用減弱，使細(xì)胞增生活躍和異常增生，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生。

本研究對(duì)β-catenin、DKK-1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)做了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜樣腺癌中β-catenin在胞膜/胞質(zhì)中的表達(dá)與DKK-1的表達(dá)呈正相關(guān)。提示子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生發(fā)展在一定程度上是由于β-catenin在胞膜/胞質(zhì)中的異常表達(dá)所致,β-catenin在胞膜/胞質(zhì)中的表達(dá)與DKK-1的表達(dá)起一定的協(xié)同作用。而17例正常增生期子宮內(nèi)膜和20例單純性增生子宮內(nèi)膜中β-catenin和DKK-1兩種蛋白之間不存在相關(guān)性。這有可能與病例數(shù)較少有關(guān)，也可能與試劑及Wnt通路復(fù)雜有關(guān)。近年來(lái)，雖然在Wnt通路研究中，取得了較大進(jìn)展，但在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待進(jìn)一步深入的研究。

[1] 樂(lè)杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第7版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.272.

[2] Sakanaka C,Sun TQ,Williams LT.New steps in the Wnt/beta-catenin signal transduction pathway[J].Recent Prog Horm Res,2000,55:225-236.

[3] Liao X,Siu MK,Au CW,et al.Aberrant activation of hedgehog signaling pathway contributes to endometrial carcinogenesis through beta-catenin[J].Mod Pathol,2009,22(6):839-847.

[4] Liu B,Yu HM,Huang J,et al.Co-opted JNK/SAPK signaling in Wnt/bate- catenin-induced tumorigenesis[J].Neoplasia,2008,10(9):1004-1013.

[5] 吳時(shí)敏,郭峻莉,周晟，等.β-catenin和cyclin在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7(11)：1997-1998.

[6] Tulac S,Overgaard MT,Hamilton,et al.Dickkopf-1,an inhibitor of Wnt signaling,is regulated by progesterone in human endometrial stromal cells[J].J Clin Endocrinol Metab,2006,91(4):1453-1461.

[7] 賴巧紅,章漢旺.Dickkopf-1 mRNA在妊娠小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2005，15(3)：184-187.

[8] Yi N,Liao QP,Xiong Y.Novel expression profiles and invasiveness-related biology function of DKK-1 in endometrial carcinoma[J].Oncol Rep,2009,21(16):1421-1427.

[9] Wu R,Hendrix-Lucas N,Kuick R,et al.Mouse model of human ovarian endometrioid adenocarinoma based on somatic defects in the Wnt/beta-catenin and p13k/pten signaling pathways[J].Cancer Cell,2007,11(4):321-333.

[10] Jeong JW,Lee HS,Franco HL,et al.beta-catenin mediates glandular formation and dysregulation of beta catenin induces hyperplasia formation in the murine uterus[J].Oncogene,2009,28(1):31-34.

[11] Daikoku T,Song H,Guo Y,et al.Uterine MSX-1 and Wnt-4 signaling becomes aberrant in mice with the loss of leukemia inhibitory factor or Hoxa10:evidence for a novel cytokine-homeobox-Wnt signaling in implantation[J].Mol Endocrinol,2004,18:1238-1250.

[12] 周留林,楊繼實(shí),陳友國(guó),等.β-catenin和APC蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2008,12(7)：32-35.

[13] Lowy AM,Fenoglio-Preiser C,Kim OJ,et al.Dysregulation of beta-catenin expression correlates with tumor differentiation in pancreatic duct adenocarcinoma[J].Ann Surg Oncol,2003,10(3):284-290.

[14] Qiao L,Xu ZL,Zhao TJ,et al.DKK-1 secreted by mesenchymal stem cells inhibits growth of breast cancer via depression of Wnt signaling[J].Cancer Lett,2008,269(1):67-77.

[15] Yi N,Liao QP,Xiong Y.Novel expression profiles and invasiveness-related biology function of DKK-1 in endometrial carcinoma[J].Oncol Rep,2009,21 (16):1421-1427.

[16] Kuang HB,Miao CL,Guo WX,et al.Dickkopf-1 enhances migration of HEK293 cell by beta-catenin/E-cadherin degradation[J].Front Biosci,2009,14:2212-2220.

[17] Zhu Y,Sun Z,Han Q,et al.Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1[J].Leukemiia,2009,23(5):925-933.