苯甲基磺酰氟對(duì)三鄰甲苯磷酸酯暴露母雞腦組織基因表達(dá)譜的影響

王祥虎，樸豐源

(大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

一些有機(jī)磷化合物(OPs)可誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)毒性(OPIDN)。其病理特點(diǎn)是中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)軸突變性及脫髓鞘，以周圍神經(jīng)長軸突損害為主。對(duì)OPIDN的發(fā)病機(jī)制，有不少假說，其中主要集中在Johnson[1]提出的“神經(jīng)毒性酯酶學(xué)說”和Abou-Donia等[2]提出的“鈣穩(wěn)態(tài)失衡學(xué)說”上，另有學(xué)者認(rèn)為OPIDN是由T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)。由于這些OPs既具有急性毒性又有OPIDN，使得在OP暴露早期階段，很難把由急性毒性和OPIDN作用各自引起的一些分子毒理學(xué)變化加以區(qū)分，給OPIDN本身的深入研究帶來了困難，OPIDN的發(fā)病機(jī)制到目前仍不清楚。

苯甲基磺酰氟(PMSF)是一種非有機(jī)磷化合物，在OPs暴露前給予時(shí)可防止誘發(fā)OPIDN，但對(duì)OPs的急性毒性不產(chǎn)生影響[3,4]。三鄰甲苯磷酸酯 (tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)，屬有機(jī)磷類化合物，常作為經(jīng)典的OPIDN誘發(fā)劑。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)PMSF這一特點(diǎn)，以雞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過觀察PMSF干預(yù)對(duì)TOCP暴露雞大腦組織基因表達(dá)譜的影響，篩選與OPIDN相關(guān)的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步研究OPIDN的發(fā)病機(jī)制提供靶基因信息譜。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

TOCP (化學(xué)純度>96%)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)；RNeasy Mini試劑盒(OIAGEN公司)；DEPC-Water(Ambion公司)； Gene ArrayTM掃描儀3000 (Affymetrix公司)、基因芯片雜交箱640(Affymetrix公司)、Microarray Suite Version 5.0分析軟件(Affymetrix公司)。其他試劑均為分析純試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

羅曼鶴母雞12只，10月齡，體重1.5～2.0 kg，由大連市韓偉養(yǎng)雞場提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、TOCP組和PMSF前干預(yù)組，每組4只。所有實(shí)驗(yàn)雞均在給藥前15 min給予阿托品(10 mg/kg,皮下注射)以防止急性膽堿能中毒。TOCP組一次性灌胃給予TOCP (1000 mg/kg)， PMSF前干預(yù)組先皮下注射PMSF (40 mg/kg)，再一次性灌胃給予TOCP (1000 mg/kg)，對(duì)照組一次性灌胃給予生理鹽水(1000 mg/kg)。給藥后每天檢查實(shí)驗(yàn)雞的變化及運(yùn)動(dòng)功能，第5天將動(dòng)物麻醉放血處死，并立即取腦組織儲(chǔ)存于RNA later儲(chǔ)存液中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因芯片

1.3.1 總RNA的提?。簩悠钒床煌幚矸绞?對(duì)照、TOCP和PMSF前干預(yù)組)分成3個(gè)樣品，分別在液氮中進(jìn)行研磨至粉末狀，待液氮揮發(fā)干，按照TRIzol試劑盒的操作說明從腦組織中提取總RNA。

1.3.2 定量和檢測總RNA：用紫外分光光度計(jì)檢測 RNA的產(chǎn)量，在260 nm處的吸光度(A)，1 A=40 μg/mL。根據(jù)在 260 nm和280 nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的A260/A280比值應(yīng)接近2.0 (比值最好在 1.9～2.1 之間)。再用變性膠電泳質(zhì)檢測RNA是否有降解。

1.3.3 純化總RNA：將總 RNA的體積用 RNase-free 的水調(diào)整到 100 μL，加入 350 μL RLT工作液充分混勻。加入 250 μL無水乙醇，充分混勻(不要離心)。將混好的 700 μL樣品加到 QIAGEN純化柱中，>8000 r/min，離心 15 s。棄濾液，加入 500 μL RPE工作液(1份 RPE 加入4 份無水乙醇混勻而成)，>8000 r/min，離心 2 min。將純化柱放入1個(gè)新的收集管，12000 r/min，離心 1 min。將純化柱換入1個(gè) EP 管中，在純化柱膜中間加 25 μL RNase-free 的水，室溫放置 1 min，12000 r/min，離心 1 min。將 EP管中的樣品移入1個(gè)新的 EP管中。

1.3.4 基因芯片雜交：將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，合成的同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記；生物素標(biāo)記的cRNA探針經(jīng)片段化處理后與Chick Genome 430 2.0 Araay基因芯片在雜交箱640中45%雜交16 h，然后于全自動(dòng)芯片洗滌工作站450中洗脫、染色；最后用Gene Array TM掃描儀3000掃描雜交信號(hào)。

1.4 基因芯片數(shù)據(jù)處理和生物學(xué)信息分析

雜交結(jié)果用 Microarray Suite Version 5．0軟件進(jìn)行分析。在對(duì)單個(gè)樣本表達(dá)分析的前提下，根據(jù)P<0.04為表達(dá)，0.04～0.06為臨界，P>0.06為不表達(dá)，分別建立對(duì)照組、TOCP組和PMSF前干預(yù)組大腦皮質(zhì)全基因表達(dá)譜；然后將基因表達(dá)譜進(jìn)行兩兩比較，表達(dá)差異倍數(shù) >2為表達(dá)上調(diào)，表達(dá)差異倍數(shù)<-2為表達(dá)下調(diào)，篩選得到基因探針號(hào)輸入NetAffy網(wǎng)站 (www．a(chǎn)ffmetrix.con)中進(jìn)行批量處理查詢(Batch Query)，查詢出對(duì)應(yīng)的基因和生物學(xué)信息。

2 結(jié) 果

2.1 TOCP暴露雞腦組織中差異表達(dá)基因

TOCP暴露雞腦組織中的差異表達(dá)基因數(shù)量見圖1。與對(duì)照組比較，TOCP組雞腦組織中共有462個(gè)基因差異表達(dá)有顯著性意義，其中上調(diào)基因261個(gè)和下調(diào)基因201個(gè)。

圖1 TOCP暴露雞腦組織差異表達(dá)基因結(jié)果Fig 1 Result of the differentially expressed genes in the brain tissue of TOCP-treated hensA組：與對(duì)照組比較,TOCP暴露組雞腦組織中表達(dá)差異有顯著性意義的基因總數(shù); B組：與對(duì)照組比較,TOCP暴露組雞腦組織中表達(dá)有顯著上調(diào)的基因數(shù); C組：與對(duì)照組比較,TOCP暴露組雞腦組織中表達(dá)有顯著下調(diào)的基因數(shù)

2.2 TOCP暴露雞腦組織中OPIDN相關(guān)差異表達(dá)基因

如圖2所示，從 TOCP組雞腦組織中共篩選出與對(duì)照組比較表達(dá)差異有顯著性意義而與PMSF前干預(yù)組比較差異無顯著性意義的基因311個(gè)，其中包括上調(diào)基因171個(gè)和下調(diào)基因140個(gè)。

圖2 TOCP暴露雞腦組織OPIDN相關(guān)差異表達(dá)基因結(jié)果Fig 2 Result of the differentially expressed genes related OPIDN in the brain tissue of TOCP-treated hensA組：TOCP組中與對(duì)照組比較表達(dá)差異顯著而與PMSF前干預(yù)組比較差異無顯著性意義基因總數(shù); B組：TOCP組中與對(duì)照組比較表達(dá)顯著上調(diào)而與PMSF前干預(yù)組比較差異無顯著性意義基因數(shù)；C組：TOCP組中與對(duì)照組比較表達(dá)顯著下調(diào)而與PMSF前干預(yù)組比較差異無顯著性意義基因數(shù)

對(duì)TOCP組雞腦組織中與對(duì)照組比較差異表達(dá)3倍以上，且在PMSF前干預(yù)組無差異表達(dá)的基因，作為OPIDN密切相關(guān)基因，共篩選36個(gè)。其中與對(duì)照組比較表達(dá)上調(diào)的基因有17個(gè)(表1)，主要包括離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)功能蛋白基因。與對(duì)照組比較表達(dá)下調(diào)的基因有19個(gè)(表2)，主要包括細(xì)胞凋亡、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞代謝等相關(guān)功能蛋白基因。

表1 OPIDN密切相關(guān)上調(diào)基因Tab 1 The up-regulated genes closely related to OPIDN

3 討 論

一些OPs同時(shí)具有急性毒性和OPIDN[6-8]，使得在OPs暴露早期階段，很難把由急性毒性和OPIDN各自誘發(fā)所引起的一些基因或蛋白的差異表達(dá)變化加以鑒別，給OPIDN本身的深入研究帶來了困難。而PMSF在OPs暴露前給予時(shí)，可防止OPs誘發(fā)OPIDN，但對(duì)OPs的急性毒性不具有拮抗作用[3,4]。利用PMSF這一特點(diǎn)，通過PMSF干預(yù)可從OPs暴露動(dòng)物模型的神經(jīng)組織中篩選OPIDN相關(guān)差異表達(dá)基因線索。

表2 OPIDN密切相關(guān)下調(diào)基因Tab 2 The down-regulated genes closely related to OPIDN

本研究結(jié)果顯示，在TOCP暴露組雞腦組織基因表達(dá)譜38535個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，共篩出與對(duì)照組比較有顯著差異表達(dá)的基因462個(gè)，可能與急性毒性或OPIDN或兩者相關(guān)。在這些基因中，與對(duì)照組比較表達(dá)差異有顯著性意義且與PMSF前干預(yù)組差異無顯著性意義的匹配基因有311個(gè)，可能與誘發(fā)OPIDN有關(guān)。尤其與對(duì)照組比較差異表達(dá)3倍以上，且在PMSF前干預(yù)組無差異表達(dá)的基因，共篩選36個(gè)，可能與誘發(fā)OPIDN密切相關(guān)。其中上調(diào)基因17個(gè)和下調(diào)基因19個(gè)，主要包括離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞代謝等相關(guān)功能蛋白基因。這些基因中一些基因的功能蛋白已引起部分學(xué)者的關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道，TOCP暴露組雞腦組織微管相關(guān)蛋白2(MAP2)含量顯著增高，認(rèn)為這種改變可能與遲發(fā)性神經(jīng)毒性誘發(fā)有關(guān)[4,5]。王英鵬等[9]發(fā)現(xiàn)，在雞OPIDN 發(fā)病過程中出現(xiàn)腰髓前角神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，認(rèn)為細(xì)胞凋亡可能在OPIDN 發(fā)病機(jī)制中起重要作用。從本研究基因芯片結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相關(guān)聯(lián)的基因都出現(xiàn)明顯的差異表達(dá)，進(jìn)一步從基因水平證實(shí)了上述文獻(xiàn)的結(jié)果。

通過PMSF干預(yù)，從TOCP暴露雞腦組織中篩選出可能與OPIDN誘發(fā)相關(guān)的基因信息譜，今后應(yīng)對(duì)這些基因進(jìn)一步從蛋白水平加以驗(yàn)證，并深入探索與OPIDN誘發(fā)之間的關(guān)聯(lián)性。

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