不同轉(zhuǎn)移特性的人鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1表達(dá)及其意義

張香梅 陳培芬 劉 芳

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的1種惡性腫瘤，尤以廣東省珠江三角洲一帶多見(jiàn)，俗有“廣東癌”之稱。雖然近年來(lái)鼻咽癌的診斷和治療水平已有很大提高，但鼻咽癌的5年生存率仍很低，究其原因，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者治療效果和死亡的關(guān)鍵[1]。目前已發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的分子標(biāo)志物主要有VEGF、CXCR4、CD44、Cadherin、MMP、nm-23、Wt-p53等[2]，有關(guān)T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1,Tiam-1)基因在鼻咽癌細(xì)胞株中的功能研究目前少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR等方法，分別檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移特性的人鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1表達(dá)，分析Tiam-1基因與人鼻咽癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移特性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇高成瘤高轉(zhuǎn)移特性鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、成瘤具有一定轉(zhuǎn)移特性鼻咽癌細(xì)胞株CNE2 、C666-1以及成瘤無(wú)轉(zhuǎn)移特性鼻咽癌細(xì)胞株6-10B(其中5-8F、CNE2、6-10B由中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所建系、C666-1由香港中文大學(xué)建系)置南方醫(yī)院腫瘤研究所細(xì)胞庫(kù)凍存。濃縮型兔抗人Tiam-1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；免疫組化SP-9000試劑盒、DAB顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；TRIzol和RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；Tiam-1和GAPDH引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2細(xì)胞均在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)前一天胰酶消化6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度(2×105個(gè)/ml)后制作細(xì)胞爬片，次日待細(xì)胞約30%～50%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定15 min，再用10%正常羊血清封閉30 min，不洗，然后加入Tiam-1一抗(1∶200稀釋)，4℃過(guò)夜孵育。次日棄去一抗，PBS沖洗后加入酶標(biāo)二抗(抗兔)，室溫孵育1 h，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后用中性樹(shù)脂封固。PBS液取代一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 RT-PCR方法 待細(xì)胞長(zhǎng)至狀態(tài)良好，鋪滿瓶壁后用TRIzol試劑常規(guī)提取人鼻咽癌6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2細(xì)胞總RNA； 1%瓊脂糖凝膠電泳判斷其完整性、分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度后，再各取1μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作生成cDNA，然后以此為模板各取1 μl，在94°C 40 s、60°C 30 s、72℃ 45 s條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，共30個(gè)循環(huán)。Tiam1引物為5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′，5′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′，擴(kuò)增片段為253 bp，看家基因GAPDH為內(nèi)對(duì)照，引物為5′- AATCCCATCACCATCTTCCA -3′，5′- CCTGCTTCACCACCT TCTTG-3′ -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為580 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SAS 6.12軟件進(jìn)行分析。完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本均數(shù)比較用方差分析，等級(jí)資料的相關(guān)關(guān)系用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)移特性鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1蛋白表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，Tiam-1蛋白在全部5-8F細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕黃、棕褐色強(qiáng)表達(dá)，在大部分6-10B細(xì)胞中呈微弱的淡黃色弱表達(dá)或不表達(dá)，在C666-1、CNE2細(xì)胞質(zhì)中呈黃色中度表達(dá)。

2.2 不同轉(zhuǎn)移特性人鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1 mRNA的表達(dá)

所提取的4種人鼻咽癌細(xì)胞株總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，結(jié)果表明其OD值(A260/280)均在1.8～2.0之間，電泳檢測(cè)有3條清晰的rRNA帶：28 s、18 s和5 s，說(shuō)明RNA無(wú)降解，質(zhì)量較好(圖1)。

應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)4種人鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1 mRNA的表達(dá)，采用1-D ADVANCED軟件進(jìn)行區(qū)帶的灰度分析，分別以Tiam-1和 GAPDH擴(kuò)增帶的密度比值表示各腫瘤細(xì)胞株的表達(dá)水平。結(jié)果表明Tiam-1基因在鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F中的密度比值為0.817±0.040，無(wú)轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞株6-10B中為0.103±0.015，C666-1、CNE2細(xì)胞中分別是0.383±0.025、0.497±0.047，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=220.770，P<0.05)，且與轉(zhuǎn)移特性的高低呈正相關(guān)關(guān)系(γs =0.852，P<0.05，圖2，表1)。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性

圖2 RT-PCR方法檢測(cè)不同鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1表達(dá)

表1 4種鼻咽癌細(xì)胞中Tiam-1基因的表達(dá)分析

△為采用SNK法，各種細(xì)胞間比較P均<0.05；γs為Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)

3 討論

Tiam-1基因是1種原癌基因，最初是從小鼠T淋巴瘤細(xì)胞高侵襲變異株中分離鑒定得到[3]。許多研究表明Tiam-1基因在多種惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，且其表達(dá)水平與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[4～9]。Habets等[10]通過(guò)對(duì)不同淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等細(xì)胞株中Tiam-1表達(dá)進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)Tiam-1基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移特性有一定的聯(lián)系。在鼻咽癌研究方面羅元等[11]曾對(duì)41例不同臨床分期人鼻咽癌組織以及20例鼻咽粘膜慢性炎癥組織中Tiam-1的表達(dá)進(jìn)行分析，認(rèn)為鼻咽癌組織中Tiam-1蛋白表達(dá)要高于鼻咽粘膜慢性炎癥組織，并與鼻咽癌臨床分期等具有相關(guān)性。在前期的研究中，我們?cè)弥|(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含Tiam-1 cDNA的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CNE1和C666-1人鼻咽癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Tiam-1 蛋白過(guò)表達(dá)明顯增強(qiáng)了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的黏粘附、遷移及侵襲能力[12]。因此，有關(guān)Tiam-1基因在不同人鼻咽癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中的表達(dá)及與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移特性的關(guān)系值得研究。研究表明，同一惡性腫瘤組織可由不同的腫瘤細(xì)胞亞系組成，它們大多具有不同的生物學(xué)行為，表現(xiàn)出不同的臨床和(或)病理學(xué)特性[13，14]。5-8F細(xì)胞株具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移特性[15]；6-10B細(xì)胞株具有成瘤、不轉(zhuǎn)移特性[15]；CNE2、C666-1細(xì)胞株具有成瘤和一定的轉(zhuǎn)移特性[16～18]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞株中Tiam-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tiam-1在具有高轉(zhuǎn)移特性的5-8F鼻咽癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，在沒(méi)有轉(zhuǎn)移特性的6-10B細(xì)胞中Tiam-1呈弱表達(dá)，而在具有一定轉(zhuǎn)移能力的C666-1、CNE2細(xì)胞中Tiam-1呈中度表達(dá)，說(shuō)明Tiam-1表達(dá)水平與鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)關(guān)系，與Bourguignon等[19]在乳腺癌、劉莉等[20]在結(jié)直腸癌、Engers等[21]在前列腺癌細(xì)胞系中研究所得出的結(jié)論一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們前期的研究結(jié)果[12]。

因此，Tiam-1可以作為判斷鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移能力大小的1個(gè)參考指標(biāo)。

[1] 蔣家澧.鼻咽癌相關(guān)分子機(jī)制的最新研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,4(29):5.

[2] 尚云峰.鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志,2008,16(2):157.

[3] Habits’ G G,Scholtes E H,Zuydgeest D,et al.Identification of an invasion-inducing gene,Tiam-1,that encodes a protein with homology to GDP/GTP exchangers for Rho-like proteins〔J〕.Cell,1994,77(4):537.

[4] Hou M,Tan L,Wang X,et al.Antisense Tiam-1 down-regulates the invasiveness of 95D cells in vitro〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2004,36 (8):537.

[5] Minard M E,Kim L S,Price J E,et al.The role of the guanine nucleotide exchange factor Tiam-1 in cellular migration,invasion,adhesion and tumor progression〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2004,84 (1):21.

[6] Wang H H,Huang G W,Lin L,et al.Correlation between expression of Tiam-1 gene and carcinomas of larynx〔J〕.Chinese Journal of Clinical Laboratory Science,2006,24(1):49.

[7] Liu L,Xu A G,Wang W,et al.Expression of Tiaml in colorectal carcinomas and its clinical significance〔J〕.J Clin Exp Pathol,2006,22(2):137.

[8] Minard M E,Herynk M H,Collard J G,et al.The guanine nucleotide exchange factor Tiam-1 increases colon carcinoma growth at metastatic sites in an orthotopic nude mouse model〔J〕.Oncogene,2005,24 (15):2568.

[9] 朱金明,余佩武.T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2005,13(3):320.

[10] Habets G G,van der Kammen R A,Stam J C,et al.Sequence of the human invasion-inducing Tiam-1 gene,its conservation in evolution and its expression in tumor cell lines of different tissue origin〔J〕.Oncogene,1995,10(7):1371.

[11] 羅 元,趙惠柳,莫立根.Tiam-1 mRNA 及其蛋白的表達(dá)與鼻咽癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2007,23(3):342.

[12] 張香梅,丁 軼,陳娟芝,等.Tiam-1在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.中華病理學(xué)雜志,2009,38(4):268.

[13] Fidler IJ.Critical factors in the biology of human cancer metasis:twenty-eight G.H.A.clows memorial award lecture〔J〕.Cancer Res，1990,50:6130.

[14] 顏 政，方馳華.人肝細(xì)胞癌細(xì)胞亞群的克隆分離及異質(zhì)性機(jī)制的初步研究〔J〕.世界華人消化雜志.2006，14(5)：481.

[15] 宋立兵,鄢 踐,汪慧民,等.鼻咽癌細(xì)胞亞株不同成瘤與轉(zhuǎn)移潛能的分子機(jī)制〔J〕.癌癥,2002,12(2):158.

[16] 李 青.低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞系CNE-2Z的生物學(xué)特性和應(yīng)用現(xiàn)狀〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)〔J〕,2007,25(5):571.

[17] Hui AB,Cheung ST,Fong Y,et al.Characterization of a new EBV-associated nasopharyngeal carcinoma cell line〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,1998,101(2):83.

[18] Cheung ST,Huang DP,Hui AB,et al.Nasopharyngeal carcinoma cell line (C666-1) consistently harbouring Epstein-Barr virus〔J〕.Int J Cancer,1999,83(1):121.

[19] Bourguignon LY,Zhu H,Shao L,et al.Ankyrin-Tiam-1 interaction promotes Rac1 signaling and metastatic breast tumor cell invasion and migration〔J〕.J Cell Biol,2000,150(1):177.

[20] 劉 莉,許岸高,王 蔚，等.大腸腫瘤中Tiam-1的表達(dá)及臨床意義〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2006,22(2):137.

[21] Engers R,Mueller M,Walter A,et al.Prognostic relevance of Tiam-1 protein expression in prostate carcinomas〔J〕.Br J Cancer,2006,95:1081.