抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄、翻譯及亞細(xì)胞定位的影響

高波,段志堅(jiān),徐薇,熊思東

復(fù)旦大學(xué)免疫生物研究所,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,上海200032

三結(jié)構(gòu)域(tripartite motif,TRIM)蛋白家族均含有1個(gè)RING(really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域、1或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil)。60%的TRIM蛋白在C端還有SPRY結(jié)構(gòu)域[1]。TRIM家族蛋白與機(jī)體的多種生理功能有關(guān),如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等[1,2]。尤為值得關(guān)注的是,近年研究發(fā)現(xiàn)多種TRIM家族蛋白在抗病毒免疫中起重要作用[3-7],提示TRIM家族蛋白是一類廣泛存在的、新型的抗病毒固有免疫分子[8,9]。TRIM22是干擾素誘導(dǎo)蛋白,多項(xiàng)研究表明它可有效抑制人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的復(fù)制,是干擾素抑制HIV-1復(fù)制的關(guān)鍵效應(yīng)分子[5,10,11]。另外,在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染猩猩的肝基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),TRIM22與HBV及HCV的清除均有關(guān)[12],說明TRIM22亦可能在肝臟的抗病毒免疫中發(fā)揮作用。TRIM22的C端含有SPRY結(jié)構(gòu)域。新近研究發(fā)現(xiàn)SPRY結(jié)構(gòu)域在TRIM22的分子進(jìn)化過程中起重要作用,并很可能與TRIM22對病毒的識別有關(guān)[13]。為研究SPRY結(jié)構(gòu)域在TRIM22抗病毒免疫中的作用,本研究構(gòu)建TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變體,并對該突變體的功能進(jìn)行初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變體在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上與野生型并無差異,但它完全喪失了核定位能力。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人高分化的肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株為本研究室保存。

1.2 試劑

真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1、TRIzol試劑購自Invitrogen公司。兩步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品。DNA聚合酶LaTaq、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶NheⅠ、HindⅢ均為TaKaRa公司產(chǎn)品。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。膠回收試劑盒購自上海華舜公司。質(zhì)粒提取使用Qiagen公司的質(zhì)粒中量抽提試劑盒。鼠抗c-myc抗體(克隆號9E10)、鼠抗人GAPDH抗體及FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗均購自Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自上海康成生物工程有限公司。硝酸纖維素膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為Amersham公司產(chǎn)品。

1.3 帶Myc表位的TRIM22-ΔSPRY真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建的野生型TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒[14]為模板,PCR擴(kuò)增C端帶Myc表位的SPRY結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM22基因,上游引物:5′-CAGGCTAGCATGGATTTCTCAGTAAAGGTAGAC-3′(NheⅠ),下游引物:5′-CTGAAGCTTTCACAGGTCTTCTTCAGAGATCAGTTTCTGTTCA

GGTCAGTTAGCCTTGCCT-3′(HindⅢ),下劃線為酶切位點(diǎn)序列。對PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1分別用NheⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,用T4 DNA連接酶在16 ℃將目的基因片段插入pcDNA3.1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取可疑陽性克隆,進(jìn)行菌落PCR及雙酶切鑒定,并將陽性克隆送測序。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中。利用磷酸鈣沉淀法將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染16 h后,用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗2遍,然后加入新鮮培養(yǎng)基。

1.5 RT-PCR

收集HepG2細(xì)胞,用TRIzol試劑抽提細(xì)胞總RNA,并用DNaseⅠ處理1 h以清除殘余DNA。取總RNA 1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件:72 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min。采用Oligo(dT)18引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán);然后72 ℃ 10 min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠成像儀上拍攝成像并進(jìn)行灰度掃描。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法

收集轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞,置細(xì)胞裂解液中,經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離。電泳后,采用濕法(300 mA,90 min)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。經(jīng)封閉液(5%脫脂奶粉-TBST)封閉2 h后,分別加入1∶500稀釋的鼠抗c-myc單克隆抗體和1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH單克隆抗體(用TBST稀釋),4 ℃過夜,漂洗3次,每次10 min。加入羊抗鼠IgG-HRP(TBST稀釋1∶500),室溫作用2 h,漂洗3次,每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光法成像和顯影。

1.7 間接免疫熒光分析

將HepG2以1×106個(gè)/ml鋪于放有玻璃蓋片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)48 h后通過磷酸鈣沉淀法將TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。48 h后將玻璃蓋片取出,用4%中性甲醛固定30 min,PBS洗3次;0.2% Triton X-100冰上透化10 min,PBS洗3次;1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉1 h,PBS洗3次;與1∶500稀釋的鼠抗c-myc單克隆抗體4 ℃孵育過夜,PBS洗3次;與1∶1 000稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫避光孵育2 h,PBS洗3次;與1∶500稀釋的DAPI避光作用10 min,PBS洗3次;甘油封片后鏡檢、拍照。

2 結(jié)果

2.1 TRIM22 SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建與鑒定

為研究SPRY結(jié)構(gòu)域在TRIM22抗病毒過程中的作用,以本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建的野生型TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增C端帶Myc表位、SPRY結(jié)構(gòu)域缺失的基因片段,再將其克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1中。SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變體(ΔSPRY)的菌落PCR和酶切鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)缺失SPRY結(jié)構(gòu)域的TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功、讀碼框架正確無誤(圖1)。

A: Identification of plasmid expressing TRIM22-ΔSPRY by colony PCR. 1, DNA marker; 2, TRIM22-ΔSPRY PCR products; 3, negative control. B: Identification of plasmid expressing TRIM22-ΔSPRY by restrict endonuclease digestion. 1, DNA marker; 2, pcDNA/TRIM22-ΔSPRY digested withNheⅠandHindⅢ.

圖1TRIM22SPRY結(jié)構(gòu)域突變體的構(gòu)建與鑒定

Fig.1ConstructionofeukaryoticexpressionvectorforTRIM22-ΔSPRY

2.2 TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄的影響

為研究TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄的影響,將表達(dá)野生型TRIM22和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后通過半定量RT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變型TRIM22在轉(zhuǎn)錄水平上與野生型TRIM22沒有明顯差異(圖2)。

圖2TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄的影響

Fig.2TheeffectoftheTRIM22SPRYdomainonitstrans-cription

2.3 TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浞g的影響

為研究TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浞g的影響,將帶Myc表位的野生型和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變的TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后利用抗Myc抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測。在約55×103和33×103處分別檢測出野生型TRIM22和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變型TRIM22的表達(dá),與預(yù)期的相對分子質(zhì)量(Mr)相符,但兩者在蛋白表達(dá)水平上并無明顯差異(圖3)。

圖3TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浞g的影響

Fig.3TheeffectofTRIM22SPRYdomainonitstranslation

2.4 TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ鋪喖?xì)胞定位的影響

為研究SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)RIM22在HepG2細(xì)胞中亞細(xì)胞定位的影響,將帶Myc表位的野生型和SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變的TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,然后利用抗Myc抗體進(jìn)行免疫熒光定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型TRIM22主要定位在HepG2細(xì)胞核中,與我們以前所報(bào)道的在COS-7細(xì)胞中的結(jié)果相符[14],而SPRY結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM22則彌散分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖4),提示SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)RIM22的亞細(xì)胞定位起關(guān)鍵作用。

A: Wild type TRIM22. B: SPRY domain deleted TRIM22.

圖4TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)ζ鋪喖?xì)胞定位的影響(×400)

Fig.4TheeffectofTRIM22SPRYonitssubcellularlocalization(×400)

3 討論

TRIM蛋白屬于RING蛋白家族,迄今已發(fā)現(xiàn)近70個(gè)TRIM家族成員都含有相似的RBCC結(jié)構(gòu)序列,從蛋白肽鏈的N端到C端依次包含1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域、1或2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。60%的TRIM家族分子C端還有1個(gè)SPRY結(jié)構(gòu)域[1]。許多TRIM家族分子在抗病毒固有免疫中起重要作用,研究最為深入的是TRIM5α,具有廣泛的抗反轉(zhuǎn)錄病毒作用。恒河猴的TRIM5α分子可通過迅速降解病毒衣殼蛋白來抑制HIV-1的復(fù)制,從而抵抗HIV感染[3]。與TRIM5α在結(jié)構(gòu)和功能上最為相似的是TRIM22。TRIM22基因的染色體定位于11p15,與TRIM5緊相鄰,兩者之間的距離僅為4.8 kb[15]。新近研究發(fā)現(xiàn),TRIM22和TRIM5都表現(xiàn)出快速適應(yīng)進(jìn)化,即達(dá)爾文正向選擇(positive selection)的特點(diǎn),但由于兩者具有極大的遺傳相似性,所以不能同時(shí)進(jìn)行達(dá)爾文正向選擇[13]。多項(xiàng)研究表明,TRIM22亦可有效抑制HIV-1的復(fù)制,并與多種病毒感染有關(guān),但TRIM22的抗病毒機(jī)制迄今還不清楚[5,10,11]。

60%的TRIM分子,包括TRIM22,在C端具有SPRY結(jié)構(gòu)域。SPRY結(jié)構(gòu)域的功能多樣,與細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、RNA代謝及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放等有關(guān)。在抗病毒免疫中,SPRY結(jié)構(gòu)域可能與抗病毒特異性有關(guān)[16]。新近研究亦發(fā)現(xiàn),TRIM5α和TRIM22分子進(jìn)化的正選擇氨基酸位點(diǎn)均位于SPRY結(jié)構(gòu)域,提示SPRY結(jié)構(gòu)域可能與TRIM22對病毒的識別有關(guān)[13]。為研究SPRY結(jié)構(gòu)域在TRIM22抗病毒過程中發(fā)揮的作用,本研究對TRIM22的SPRY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行缺失突變。由于基因突變可能影響其表達(dá)水平,我們將SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變型和野生型TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,然后比較其轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)水平。結(jié)果顯示,SPRY結(jié)構(gòu)域的缺失并不影響TRIM22的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,這為后續(xù)研究中排除基因表達(dá)水平差異的影響以及研究SPRY結(jié)構(gòu)域在TRIM22抗病毒過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

研究表明多種TRIM分子以三聚體形式存在,TRIM蛋白的這種自我寡聚化能力有利于形成高M(jìn)r的復(fù)合物,從而構(gòu)成顯著的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),存在于胞核或胞質(zhì)中[1],而TRIM分子的亞細(xì)胞定位往往與其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),TRIM22主要定位于細(xì)胞核中,與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相符。為研究SPRY結(jié)構(gòu)域在TRIM22的亞細(xì)胞定位中所起的作用,我們將SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變型和野生型TRIM22真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與定位在細(xì)胞核中的野生型TRIM22不同,SPRY結(jié)構(gòu)域缺失突變體彌散分布在細(xì)胞質(zhì)中,提示SPRY結(jié)構(gòu)域?qū)RIM22的核內(nèi)定位起關(guān)鍵作用,為進(jìn)一步闡明該結(jié)構(gòu)域在TRIM22抗病毒免疫中的作用和機(jī)制提供有益的啟示。

[1] Reymond A, Meroni G, Fantozzi A, Merla G, Cairo S, Luzi L, Riganelli D, Zanaria E, Messali S, Cainarca S, Guffanti A, Minucci S, Pelicci PG, Ballabio A. The tripartite motif family identifies cell compartments [J]. EMBO J, 2001, 20(9): 2140-2151.

[2] Meroni G, Diez-Roux G. TRIM/RBCC, a novel class of ‘single protein RING finger’ E3 ubiquitin ligases [J]. Bioessays, 2005, 27(11): 1147-1157.

[3] Stremlau M, Owens CM, Perron MJ, Kiessling M, Autissier P, Sodroski J. The cytoplasmic body component TRIM5 alpha restricts HIV-1 infection in Old World monkeys [J]. Nature, 2004, 427(6977): 848-853.

[4] Regad T, Saib A, Lallemand-Breitenbach V, Pandolfi PP, de Thé H, Chelbi-Alix MK. PML mediates the interferon-induced antiviral state against a complex retrovirus via its association with the viral transactivator [J]. EMBO J, 2001, 20(13): 3495-3505.

[5] Barr SD, Smiley JR, Bushman FD. The interferon response inhibits HIV particle production by induction of TRIM22 [J]. PLoS Pathog, 2008, 4(2): e1000007.

[6] Gack MU, Shin YC, Joo CH, Urano T, Liang C, Sun L, Takeuchi O, Akira S, Chen Z, Inoue S, Jung JU. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity [J]. Nature, 2007, 446(7138): 916-920.

[7] Wolf D, Goff SP. TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells [J]. Cell, 2007, 131(1): 46-57.

[8] Nisole S, Stoye JP, Sa?b A. TRIM family proteins: retroviral restriction and antiviral defence [J]. Nat Rev Microbiol, 2005, 3(10): 799-808.

[9] Ozato K, Shin DM, Chang TH, Morse HC 3rd. TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity [J]. Nat Rev Immunol, 2008 8(11): 849-860.

[10] Tissot C, Mechti N. Molecular cloning of a new interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat expression [J]. J Biol Chem, 1995, 270(25): 14891-14898.

[11] Bouazzaoui A, Kreutz M, Eisert V, Dinauer N, Heinzelmann A, Hallenberger S, Strayle J, Walker R, Rübsamen-Waigmann H, Andreesen R, von Briesen H. Stimulated trans-acting factor of 50 kDa (Staf50) inhibits HIV-1 replication in human monocyte-derived macrophages [J]. Virology, 2006, 356(1-2): 79-94.

[12] Wieland S, Thimme R, Purcell RH, Chisari FV. Genomic analysis of the host response to hepatitis B virus infection [J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2004, 101(17): 6669-6674.

[13] Sawyer SL, Emerman M, Malik HS. Discordant evolution of the adjacent antiretroviral genes TRIM22 and TRIM5 in mammals [J]. PLoS Pathog, 2007, 3(12): e197.

[14] Duan Z, Gao B, Xu W, Xiong S. Identification of TRIM22 as a RING finger E3 ubiquitin ligase [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 374(3): 502-506.

[15] Tissot C, Taviaux SA, Diriong S, Mechti N. Localization of Staf50, a member of the Ring finger family, to 11p15 by fluorescence in situ hybridization [J]. Genomics, 1996, 34(1): 151-153.

[16] Yap MW, Nisole S, Stoye JP. A single amino acid change in the SPRY domain of human Trim5 alpha leads to HIV-1 restriction [J]. Curr Biol, 2005, 15(1): 73-78.