格特隱球菌病暴發(fā)流行機(jī)制的研究進(jìn)展

馮曉博,姚志榮

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科,上海200092

格特隱球菌原名為新生隱球菌格特變種,現(xiàn)已上升至種的水平,并被命名為格特隱球菌(Cryptococcusgattii)[1]。格特隱球菌在流行病學(xué)和所致感染的臨床特點(diǎn)上都與新生隱球菌有明顯差異[2,3]。格特隱球菌多感染免疫力正常人群,所致感染多形成肉芽腫病變,需要較長的治療周期,甚至手術(shù)清除病灶,病死率高于新生隱球菌所致感染[1],且格特隱球菌對多種抗真菌藥物敏感性較新生隱球菌低[4]。格特隱球菌主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),多引起區(qū)域性感染。然而,1999年至今在溫帶地區(qū)溫哥華島暴發(fā)的格特隱球菌病發(fā)病率是以往報道的10多倍;至2007年止,已報道感染病例218例,且感染者大部分免疫力正常[5,6]。目前,該菌已蔓延至西北太平洋地區(qū),歐洲地區(qū)也已發(fā)現(xiàn)相關(guān)病例[7-10]。本文綜述此次格特隱球菌病的流行機(jī)制。

1 分子流行病學(xué)分析

近年來,在全球范圍內(nèi)進(jìn)行的大樣本調(diào)查表明,根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)和DNA序列差異,格特隱球菌分為4種主要基因型,即VGⅠ～VGⅣ基因型(血清B、C型),主要基因型的地域分布和致病特點(diǎn)存在明顯差異[3,6,11]。2004年,Kidd等[6]對溫哥華島地區(qū)臨床株的基因型進(jìn)行分析,結(jié)果表明這種高致病性的菌株屬格特隱球菌VGⅡ基因型。進(jìn)一步的聚合酶鏈反應(yīng)指紋法(polymerase chain reaction fingerprinting,PCR fingerprinting)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)以及多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)結(jié)果顯示,主要致病株為VGⅡa/AFLP6A基因型(占90%左右),另外VGⅡb/AFLP6B基因型占10%左右。2007年,有報道在加拿大不列顛哥倫比亞低陸平原和美國華盛頓州西北部發(fā)現(xiàn)VGⅡa亞型感染的人和動物病例,并從環(huán)境中分離到該基因型,說明該菌已播散到鄰近區(qū)域[7-9];另外,在歐洲首次發(fā)現(xiàn)VGⅡa亞型感染病例[10]。2009年,在美國俄勒岡州發(fā)現(xiàn)由VGⅡa亞型所致的動物病例[12]。Fraser等[13]對全球范圍內(nèi)VGⅡ型菌株所做的MLST表明,VGⅡa亞型在較多位點(diǎn)上都具有獨(dú)特的序列特征,以此區(qū)別于世界范圍內(nèi)其他地區(qū)分離的VGⅡ型菌株,而VGⅡb亞型還出現(xiàn)于澳洲、亞洲和南美洲地區(qū)[13-15]。2008年,Feng等[16]通過PCR指紋法和4個位點(diǎn)的MLST,首次證實(shí)我國廣東地區(qū)臨床中存在VGⅡb亞型相似株,且患者從未出國,證實(shí)致病菌來自國內(nèi);交配試驗(yàn)顯示該致病株具備交配能力。最近,另有報道稱巴西帕拉州較高的格特隱球菌病發(fā)病率也與VGⅡ型菌株有關(guān)(分離率>89%),而進(jìn)一步的基因分型數(shù)據(jù)未見報道[17]。

2 致病株的來源

格特隱球菌具有異宗配合的有性生活周期,交配體系中存在α和a兩種交配型。交配過程中,交配型為α和a的單倍體細(xì)胞融合成雙核菌絲,產(chǎn)生融合的鎖狀聯(lián)合,雙核菌絲的末端分化成擔(dān)子,在擔(dān)子中進(jìn)行細(xì)胞核的融合和減數(shù)分裂,產(chǎn)生重組的擔(dān)孢子(basidiospore)。有性交配后產(chǎn)生的擔(dān)孢子直徑小、易于播散,易進(jìn)入并沉積于肺泡。動物實(shí)驗(yàn)表明,有性繁殖產(chǎn)生的擔(dān)孢子較酵母細(xì)胞具有更強(qiáng)的感染力[18]。2005年,Lin等[19]研究發(fā)現(xiàn),α和α相同交配型細(xì)胞在一定條件下可以融合成α/α二倍體單核菌絲,通過減數(shù)和有絲分裂產(chǎn)生重組的擔(dān)孢子。α與α交配型菌株在同性交配時,基因組的重組頻率與α和a交配型交配時的重組率相似;且子代細(xì)胞核型大多為單倍體,少見二倍或非整倍體,表明這種交配行為并非偶然的生物學(xué)現(xiàn)象。

對溫哥華島致病株和環(huán)境株的交配型分析表明,所有VGⅡ型菌株均為α交配型,且多數(shù)具備交配能力,尤其是VGⅡa亞型[6]。為了明確溫哥華島及周邊地區(qū)VGⅡa亞型致病株的可能來源,Fraser等[13]對世界范圍內(nèi)分離的VGⅡ型菌株進(jìn)行了MLST,結(jié)果顯示,溫哥華島的VGⅡa與VGⅡb亞型菌株親緣關(guān)系接近,而與其他地區(qū)分離的VGⅡ型菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。30個位點(diǎn)的MLST顯示,VGⅡa與VGⅡb亞型有14個位點(diǎn)相同,16個不同。另外,對交配型位點(diǎn)SXⅠα基因序列分析后推斷,VGⅡa亞型菌株由同性交配產(chǎn)生。因VGⅡb亞型菌株還出現(xiàn)于澳洲等其他地區(qū),推斷VGⅡa亞型為起源于澳洲的VGⅡb亞型與未知VGⅡ基因型間同性交配后產(chǎn)生的重組子代。然而,Meyer等[14]對世界范圍內(nèi)160多株VGⅡ型菌株進(jìn)行的PCR指紋法、AFLP分析和MLST顯示,南美洲有VGⅡa和VGⅡb亞型菌株,其中最早的分離于1986年,提出這些基因型在美洲已存在較長時間,不太可能是近期交配產(chǎn)生的。

3 毒力分析

盡管VGⅡa和VGⅡb亞型菌株在遺傳上接近,但臨床上的流行率卻又顯著不同,表明其在致病性上可能存在差異。Fraser等[13]通過建立A/Jcr小鼠吸入感染模型,證實(shí)VGⅡa亞型代表株R265毒力明顯強(qiáng)于R272和NT-13(VGⅡb亞型)(P<0.001),甚至強(qiáng)于新生隱球菌格魯比變種H99(P<0.01)。Chaturvedi等[20]通過建立BALB/c小鼠靜注感染模型,結(jié)果顯示菌株NIH444(VGⅡa亞型)的毒力強(qiáng)于WM276(VGⅠ基因型)(P<0.034)。就隱球菌已知毒力因子黑色素、多糖莢膜、磷脂酶和37 ℃生長進(jìn)行比較,結(jié)果顯示在生成黑色素方面,因作用底物不同,菌株NIH444與WM276表現(xiàn)各異;但在磷脂酶活性、莢膜形成和37 ℃生長方面兩者相似。以上數(shù)據(jù)表明,VGⅡa亞型的高流行率與其毒力較強(qiáng)有關(guān);而對已知毒力因子的分析結(jié)果提示,VGⅡa亞型毒力強(qiáng)的原因可能與未知毒力因子或毒力基因的表達(dá)有關(guān)。2009年,Ma等[21]研究發(fā)現(xiàn),VGIIa亞型在小鼠模型中表現(xiàn)的強(qiáng)毒力與其線粒體基因組的高表達(dá)及其在巨噬細(xì)胞中增強(qiáng)的復(fù)制和寄生機(jī)制相關(guān)。

4 致病菌播散機(jī)制

格特隱球菌感染主要由宿主從環(huán)境中吸入隱球菌的酵母細(xì)胞或擔(dān)孢子引起。之前認(rèn)為桉樹是格特隱球菌的棲息處,格特隱球菌感染多與環(huán)境中的桉樹有關(guān)。然而,至今已報道在除桉樹以外的較多樹種、樹根周圍的泥土、空氣、水及鳥類糞便中分離到格特隱球菌[6,7,9,22-24]。對溫哥華島的環(huán)境采樣分析顯示,當(dāng)?shù)氐臉?、泥土、空氣和水中均分離到致病株VGⅡa和VGⅡb亞型,其中,VGⅡa亞型占84%,VGⅡb亞型占12%,其余為VGⅠ基因型(4%)[7]。它們在榿木、樹莓、雪松、冷杉、橡樹、櫻桃樹的標(biāo)本(木屑、樹皮、樹洞等)中有較高的分離率,而桉樹標(biāo)本中卻未發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)本;相應(yīng)的,致病菌在這幾種樹的樹根周圍泥土中分離率也較高。研究表明,上層泥土樣本中的菌濃度顯著高于泥土下層(P<0.01);致病株的分離和高濃度與泥土中的低濕度和低有機(jī)碳含量呈正相關(guān)。在水標(biāo)本方面,海水和淡水中均分離到致病菌;在生存實(shí)驗(yàn)分析中,致病菌易存活于常溫的海水和蒸餾水中,但當(dāng)溫度降為4 ℃或提高鹽濃度后,存活率顯著下降?？諝鈽?biāo)本中,菌濃度與相對濕度呈負(fù)相關(guān),致病微粒直徑≥3.3 μm的要比直徑<3.3 μm的多;陽性空氣標(biāo)本多來自靠近陽性樹標(biāo)本的周圍,空氣標(biāo)本中菌密度均數(shù)為7 cfu/m3[7,9]。

Kidd等[25]在公共場所的水、泥土和樹標(biāo)本中分離到致病菌,提示致病菌的播散可能與人類活動介導(dǎo)傳播有關(guān)。另外,從車輪、環(huán)境采樣人員的鞋上亦分離到VGⅡa和VGⅡb亞型,甚至在與鞋接觸過的物體表面分離到致病菌,說明致病菌能被動播散。與靜態(tài)狀況相比,動態(tài)情況下,樹周圍空氣中菌濃度將增高10～140倍。以上研究結(jié)果說明,車輪、鞋、木屑等物體均可成為介導(dǎo)格特隱球菌VGⅡ基因型播散的媒介物。

綜上所述,借助遺傳學(xué)手段可推斷格特隱球菌高致病性VGⅡa亞型的可能起源,不僅為闡明這次暴發(fā)流行的根源提供依據(jù),而且可預(yù)測今后格特隱球菌病流行的發(fā)生;對格特隱球菌致病株的分子流行病學(xué)分析,有利于醫(yī)療機(jī)構(gòu)對疾病的流行進(jìn)行監(jiān)控;對格特隱球菌的播散情況進(jìn)行調(diào)查研究,有助于闡明格特隱球菌及相似病原體的播散機(jī)制,為今后該病的防治打下基礎(chǔ)。

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