PTPN22單核苷酸多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)系的研究*

柏素云 張立民 王翠香 楊志孝 張 麗 方 茜

(1.泰山醫(yī)學(xué)院生化教研室, 山東 泰安 271000; 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院風(fēng)濕免疫科, 山東 泰安 271000; 3. 泰山醫(yī)學(xué)院分析實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見(jiàn)的全身性自身免疫性疾病，全世界成人患病率約1%，該病以關(guān)節(jié)滑膜的增殖性炎癥為特征，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和關(guān)節(jié)功能障礙。對(duì)于RA的病因目前尚不十分清楚，可能與遺傳因素、環(huán)境因素、精神因素、感染等多種因素有關(guān)。其中遺傳因素是導(dǎo)致該病易感性的主要因素(約占60%)。最近，有研究表明蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)基因1858C->1858T (rs2476601)單核苷酸多態(tài)(SNP)與RA有關(guān)，但在不同地域人群中的報(bào)道不一。本研究運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)PTPN22基因1858位點(diǎn)的基因型，探討該位點(diǎn)的變異與中國(guó)泰安地區(qū)漢族人群RA易感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年修訂的RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的128例RA患者，其中男性30例，女性98例，患者年齡15～64歲；正常對(duì)照組142 例，系健康體檢者，其中男性31例，女性111例，年齡18～57歲。全部研究對(duì)象來(lái)自山東泰安地區(qū)漢族人群，相互之間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA的提取 取受檢者靜脈血200 μl，以乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝并置-70 ℃保存。使用吸附柱方法從血液中提取基因組DNA(TIANamp Blood_血液基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技北京有限公司)。

1.2.2PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)引物，F(xiàn):5′-ACT GAT AAT GTT GCT TCA ACG G-3′,R: 5′-TCA CCA GCT TCC TCA ACC AC-3′。引物購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于寶生物工程大連有限公司(TaKaRa PCR Amplification Kit)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性30 s, 54 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s,共40個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸5 min。

1.2.3基因型分析 PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶 RsaI (New England Biolabs)酶切后2.5%瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)，根據(jù)電泳結(jié)果判定每個(gè)個(gè)體的基因型。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)基因型計(jì)算等位基因頻率，檢驗(yàn)其是否符合Hardy-Weinberg平衡，各基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

基因型電泳結(jié)果：含1858C等位基因的PCR產(chǎn)物可被RsaI限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生176 bp和42 bp兩個(gè)片段，含突變的1858T等位基因的PCR產(chǎn)物不能被切割，因此只產(chǎn)生一個(gè)218 bp的片段。電泳結(jié)果顯示受檢測(cè)的128例RA患者和142例健康對(duì)照者PTPN22的1858位點(diǎn)全部為C等位基因，未檢測(cè)到T等位基因。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PTPN22基因型電泳結(jié)果

M:Marker;1～7:C/T, 其中42 bp的小片段在圖中未顯示。

3 討 論

遺傳因素是導(dǎo)致RA易感性的主要因素(約占60%),長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)該病易感基因的研究主要集中在人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen ，HLA)上，已發(fā)現(xiàn)RA與HLA-DRB1有很強(qiáng)的相關(guān)性。然而HLA位點(diǎn)在RA發(fā)病的家族聚集性中所發(fā)揮的作用只有約1/5～1/3[2]。因此近年來(lái)，許多學(xué)者將對(duì)RA易感基因的研究轉(zhuǎn)向HLA位點(diǎn)之外。

PTPN22現(xiàn)被認(rèn)為是除了主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)以外最重要的自身免疫性疾病危險(xiǎn)因子。PTPN22基因位于1號(hào)染色體短臂(1p13.3-p13.1)，編碼一種淋巴樣特異性磷酸酶(lymphoid-specific phosphatase ，LYP)。LYP的磷酸酶活性能使T細(xì)胞中的酪氨酸激酶Lck的已磷酸化(有活性)的394位酪氨酸去磷酸化從而負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。除了Lck以外，LYP還能結(jié)合一些其他的參與TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子包括Zap70、 CD3ε和TCRζ鏈并使之去磷酸化(無(wú)活性)從而下調(diào)TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，LYP還通過(guò)C端一個(gè)富含脯氨酸的模序與酪氨酸激酶Csk(C-terminus Src kinase，Csk)的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Csk能使Lck的505位酪氨酸磷酸化從而抑制Lck的活性。因此，Csk與LYP結(jié)合后能使Lck喪失激酶活性。PTPN22基因1858C->1858T (rs2476601)單核苷酸多態(tài)使第620位密碼子編碼的氨基酸從精氨酸變?yōu)樯彼?，?dǎo)致LYP和Csk的結(jié)合部分或完全被破壞，并且增加了LYP的內(nèi)在酶活性，從而使得一些重要的信號(hào)分子的磷酸化程度降低和相關(guān)的TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)，失去了對(duì)T細(xì)胞活化的抑制作用[3-4]。大量研究表明這種變異與多種自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病、Grave’s病等的發(fā)病相關(guān)[5]。PTPN22 1858T變異與RA的易感性、疾病進(jìn)展速度和嚴(yán)重性之間有重要聯(lián)系。Begovich等[6]于2004年首先報(bào)道PTPN22 1858T變異在北美人群中與RA易感性有關(guān)。隨后的大量研究一致表明該變異與北美、歐洲血統(tǒng)人群包括西班牙[7]、加拿大[8]、英國(guó)[9]、芬蘭[10]、北美[11]、瑞典[11]、德國(guó)[12]、荷蘭[13]的RA有關(guān)。但在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)PTPN22 1858T變異，這與歐洲及北美人群中存在一定頻率的該等位基因并且與RA易感性有關(guān)的結(jié)論不同。Ikari等[14]對(duì)1124例日本RA患者和453例健康對(duì)照者的研究發(fā)現(xiàn)PTPN22 1858T等位基因頻率極低(無(wú)論RA患者還是健康對(duì)照者的頻率都是0.0022)，這一結(jié)果與我們的研究結(jié)果相似。這種結(jié)果的出現(xiàn)可能由地域和人種之間的差異所致，而在亞洲人群中該位點(diǎn)的突變率可能極低。Kawasaki等[15]報(bào)道PTPN22 啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)rs2488457(1123G>C)的雜合子基因型與日本和韓國(guó)人1型糖尿病的急性發(fā)病有關(guān)。于志云等[16]的研究表明PTPN22基因 -1123G>C SNP與我國(guó)人群自身免疫甲狀腺病相關(guān)。這說(shuō)明進(jìn)一步研究PTPN22 基因其他多態(tài)位點(diǎn)與自身免疫病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)系，有助于評(píng)價(jià)PTPN22 基因與中國(guó)人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)系。

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