急性胰腺炎病人免疫功能的變化與細(xì)菌移位及大黃干預(yù)的關(guān)系*1

姜良富 張廣聚

(1.臨沂市人民醫(yī)院外一科，山東 臨沂 276000； 2.臨沂市蘭山區(qū)半程衛(wèi)生院，山東 臨沂 276000)

急性胰腺炎( acute pancreatitis，AP) 是腹部外科常見病，其中，重型急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)起病急驟、病情兇險(xiǎn)，盡管進(jìn)行了許多研究和改進(jìn)，但其死亡率仍然高達(dá)10%～20%左右[1]。最近的研究提示，免疫異常在AP的病情惡化中起著關(guān)鍵作用，越來越多的學(xué)者認(rèn)為AP的發(fā)病和免疫異常有關(guān)。 急性胰腺炎發(fā)病后期胰腺和胰周的繼發(fā)感染成為影響急性胰腺炎死亡率的首要因素[2]， 腸道細(xì)菌移位造成胰腺感染，這一觀點(diǎn)被大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)。本研究采用Wistar大鼠經(jīng)胰管逆行注入5%牛磺膽酸鈉溶液復(fù)制SAP模型，用流式細(xì)胞儀檢測SAP大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化并取血液、胰腺和腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，研究急性胰腺炎時(shí)細(xì)菌移位發(fā)生情況，為急性胰腺炎治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠，雌雄不限，山東大學(xué)動(dòng)物室提供。?；悄懰徕c(Sigma公司)。熒光標(biāo)記抗體: CD4-FITC、CD8-PE (eBioscience,Canada)。流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，America)。精制大黃素片(上海香山中醫(yī)院)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型制備 健康Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為3組, SAP模型組(M組，n=10)、大黃治療組(T組，n=10)和假手術(shù)組(SO組，n=10)。動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。3%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射(30 mg·kg-1)麻醉，采用上腹壁正中切口入腹，尋及十二指腸及胰膽管，用一小動(dòng)脈夾夾閉膽管近肝端，1號絲線結(jié)扎胰膽管近腸端，并用41/2#皮試針頭刺入胰膽管腸端，M組以0.2 ml·min-1的速度向胰膽管內(nèi)逆行推注5%牛磺膽酸鈉溶液(0.1 ml·100 g-1)。T組按M組方式復(fù)制SAP模型，關(guān)腹后即刻給以大黃素溶液1 ml(5 ml·100 g-1) 注入胃內(nèi)。SO組以0.2 ml·min-1的速度向胰膽管內(nèi)逆行推注生理鹽水(0.1 ml·100 g-1)后關(guān)腹。術(shù)后24 h，行頸動(dòng)脈插管，抽血3 ml作細(xì)菌培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀檢測，剖腹切取胰腺及腸系膜淋巴結(jié)作細(xì)菌培養(yǎng)。

1.2.2T淋巴細(xì)胞亞群檢測 采血樣1.8 ml，加預(yù)先配制的肝素抗凝劑0.2 ml混勻。取專用試管2支，各管依次加入CD4-FICT及CD8-PE單克隆抗體各20 μl及肝素抗凝血100 μl,充分混勻，避光保存10 min,2000 r/min離心5 min，棄上清；用PBS洗滌3遍，加入PBS 0.5 ml。樣本在流式細(xì)胞儀(FCM)上進(jìn)行檢測。

1.2.3胰腺及腸系膜淋巴結(jié)組織細(xì)菌培養(yǎng) 將取下的胰腺壞死組織及腸系膜淋巴結(jié)(MLN)各0.1 g,加入1 g無菌生理鹽水，在無菌塑料袋內(nèi)研磨成勻漿，分別取50 μl 接種于BAP、MAC，36℃培養(yǎng)18～20 h。培養(yǎng)48 h無細(xì)菌生長為無細(xì)菌生長。凡有一個(gè)菌落形成者為陽性。

1.2.4血液細(xì)菌培養(yǎng) 取血液2 ml注射入胰胨大豆胨培養(yǎng)液中，然后放入36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，疑有細(xì)菌生長時(shí)轉(zhuǎn)種BAP、MAC，36℃培養(yǎng)18～24 h后。培養(yǎng)48 h無細(xì)菌生長，為無細(xì)菌生長。凡有一個(gè)菌落形成者為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況

大鼠蘇醒后，SO組一般情況良好； M組大鼠精神萎糜、卷曲、不愿活動(dòng)，有的不能站立，反應(yīng)差，全身肌張力低。T組大鼠精神狀態(tài)及其他狀態(tài)較M組好，但較SO組差。

2.2 血中CD4、CD8陽性細(xì)胞數(shù)以及CD4+/CD8+變化

用FCM測定各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)M組大鼠血中CD4陽性細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值明顯下降，顯著低于SO組和T組(P<0.01,P<0.05)，見表1。

表1 CD4+、CD8+濃度以及CD4+/CD8+的變化

注： 與SO組比較，#P<0.01，*P<0.05；與M組比較，△P<0.05。

2.3 胰腺、血液及腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

M組血及臟器細(xì)菌培養(yǎng)陽性率較高，明顯高于T組及SO組。T組陽性率顯著低于M組。見表2。

注：與SO組比較，#P<0.01；與T組比較，*P<0.05。

3 討 論

AP的啟動(dòng)及病情演變機(jī)制十分復(fù)雜，除胰酶激活自身消化胰腺的損傷機(jī)理外，粒細(xì)胞過度激活，細(xì)胞因子的“瀑布反應(yīng)”等均參與了AP 的發(fā)生與發(fā)展的過程[2]。最近的研究提示，免疫異常在AP的病情惡化中起著重要作用，越來越多的學(xué)者認(rèn)為AP的發(fā)病和免疫異常有關(guān)。T淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要成分,體內(nèi)通過輔助性T細(xì)胞CD4+和抑制性T細(xì)胞CD8+形成的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)以維持調(diào)節(jié)免疫功能的平衡[3],二者的升高與降低,均可使兩者的比例失調(diào),導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異?；蛭蓙y[4]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，M組CD4陽性細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+的比值均較正常對照組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)M組CD8陽性細(xì)胞百分比沒有下降，與正常組相比無顯著差異。 以上結(jié)果表明SAP早期時(shí)，不僅胰腺炎癥改變嚴(yán)重，而且還存在明顯的細(xì)胞免疫功能紊亂。一方面表現(xiàn)為免疫抑制因素(CD8+)的數(shù)量變化不大；而另一方面表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能的降低(CD4+和CD4+/CD8+降低)。其主要原因可能是SAP病程中組胺、緩激肽和許多細(xì)胞因子的變化對免疫系統(tǒng)具有抑制作用。

SAP繼發(fā)胰腺及胰周感染是SAP最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其死亡率可高達(dá)80%[5]。本研究中M組血及臟器細(xì)菌培養(yǎng)陽性率較高，而SO組動(dòng)物只有兩只在腸系膜淋巴結(jié)(MLN)培養(yǎng)出細(xì)菌，其它臟器及血培養(yǎng)均為陰性。檢測出的細(xì)菌種類絕大多數(shù)為大腸桿菌?？梢娨莆患?xì)菌主要是革蘭氏陰性桿菌，與腸道內(nèi)菌群一致。以上結(jié)果表明SAP時(shí)腸道黏膜屏障破壞，腸壁通透性增加，從而引起腸道內(nèi)細(xì)菌移位。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三組動(dòng)物中腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)陽性率最高，M組、T組細(xì)菌培養(yǎng)血液及胰腺陽性率較淋巴結(jié)低，且較接近。說明由于腸菌的過度繁殖，使細(xì)菌侵入淋巴道，移位至腸系膜淋巴結(jié)，淋巴道可能是細(xì)菌最重要以及最早的侵襲途徑。然后沿淋巴結(jié)發(fā)生血行播散引起胰腺和全身感染。本研究顯示M組CD4陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值明顯降低，腸系膜淋巴結(jié)、血及胰腺細(xì)菌培養(yǎng)陽性率較高。相反經(jīng)大黃治療的T組血CD4陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值明顯高于M組，而MLN、血及臟器細(xì)菌培養(yǎng)陽性率明顯低于M組。表明 SAP時(shí)全身的免疫功能下降，與腸細(xì)菌移位有關(guān)，可能是胰腺胰周感染的主要原因之一。而機(jī)體細(xì)胞免疫功能的下降為感染的發(fā)生提供了條件。

祖國醫(yī)學(xué)本著六腑以通為用的基本理論，采用大黃等瀉下藥物治療急性胰腺炎，己取得顯著的臨床治療效果[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大黃治療后的T組動(dòng)物精神狀態(tài)等一般情況較M組好， T組血CD4+陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值明顯高于M組，MLN、血及臟器細(xì)菌培養(yǎng)陽性率明顯低于M組；表明大黃可以通過增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)免疫功能紊亂，從而減少細(xì)菌移位，發(fā)揮保護(hù)腸黏膜屏障的作用，對SAP有一定的治療作用。

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