多巴胺對豚鼠耳蝸谷氨酸受體NMDA NR1和NMDA NR2A的調節(jié)作用△

侯志強 余力生 李興啟

耳蝸的內毛細胞下突觸復合體主要包括傳入突觸(由內毛細胞和Ⅰ型聽神經元樹突的突觸小節(jié)組成)和傳出突觸(由外側橄欖耳蝸束傳出神經末梢與Ⅰ型聽神元樹突組成)[1]。傳入突觸主要依賴釋放神經遞質谷氨酸來傳遞聽覺信號[2]，而傳出突觸主要通過外側橄欖耳蝸束向突觸間隙釋放多巴胺等多種神經遞質對傳入通路進行負反饋調節(jié)[3]。多巴胺是一種抑制性神經遞質，只存在于外側橄欖耳蝸束中，對傳入通路的調控作用很可能是通過對谷氨酸及其受體功能的調節(jié)來實現(xiàn)的[4]。最近Niu等[5]對多巴胺的作用機制進行了探討，發(fā)現(xiàn)多巴胺D1受體可與谷氨酸受體1(GluR1)相互作用，從而使聽神經的活性增強，聽神經的復合動作電位(CAP)幅度增加，而耳蝸中多巴胺的作用是否還與其他谷氨酸受體相關，值得探討。本實驗通過半定量RT-PCR的方法，比較正常耳蝸及灌流不同濃度多巴胺的耳蝸灌流前后谷氨酸受體NMDA NR1和 NMDA NR2AmRNA的表達，旨在探討多巴胺的作用是否和這兩個受體相關。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride):sigma公司產品；人工外淋巴液配方(mmol/L)：NaCl 142,KCl 5.37,MgCl21.47,CaCl2·2H2O 2,HEPES 10， PH 7.0～7.4 ，滲透壓 280～320 mmol/L；速眠新:軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所； Trizol：invitrogen公司 ；RT-PCR試劑盒(ThermoScriptTMRT-PCR System)：invitrogen公司；瓊脂糖：Sigma公司。PCR儀(Gene Amp PCR System 2700，Applied Biosystems公司，美國)；凝膠電泳成像分析儀(VILBER LOURMAT公司，法國)；穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(北京六一儀器廠)；恒溫水浴箱(北京長風儀器儀表公司)；恒溫離心機(Hettich公司，德國)；紫外分光光度儀(BECKMAN Coulter, DU800，德國)。

1.2實驗動物及分組 選用健康、耳廓反射靈敏的雜色豚鼠40只，體重300～400 g，雌雄兼用，采用隨機數(shù)字表法將動物分組，每組10只，各組均以右側耳為實驗耳，分別全耳蝸灌流不同濃度的多巴胺和人工外淋巴液，并以人工外淋巴液灌流組的對側(左側)耳蝸為正常對照組，則共有5組(每組10耳)： ①正常耳蝸組，②人工外淋巴液組，③10 mmol/L多巴胺組，④30 mmol/L多巴胺組，⑤50 mmol/L多巴胺組。

1.3全耳蝸灌流和耳蝸標本制備 將豚鼠用適量速眠新麻醉固定后，從頸部腹側進路打開實驗側聽泡暴露耳蝸，在耳蝸底回前庭階和鼓階各打一小孔，以玻璃微電極從鼓階灌入不同濃度的多巴胺和人工外淋巴液，并在圓窗龕處放置銀絲電極，參考電極置于雙側耳緣，地線接鼻尖。灌流時間為2 h，在鉆孔前、鉆孔后(灌流0 h)、灌流1 h、灌流2 h記錄耳蝸復合動作電位(CAP)，由Blackman短純音(4 000 Hz)誘發(fā)的CAP由圓窗電極引入EGG放大器(放大500倍，帶通濾波器低通1 500 Hz，高通100 Hz，疊加1 024次)。實驗中將動物放在暖水袋上，以保持動物在麻醉后的體溫，用溫度計隨時監(jiān)測動物體溫。灌流2 h后，立刻將動物斷頭處死，于解剖顯微鏡下分別取出各組灌流側耳蝸和人工外淋巴液組對側耳蝸，置于去RNA酶的EP管中，立即放液氮速凍后存放于-70℃冰箱中備RT-PCR用。

1.4RT-PCR方法

1.4.1RNA的提取和反轉錄 用RT-PCR試劑盒提取RNA，取2 μl總RNA溶液加入48 μlDEPC水中稀釋成1:25溶液，采用紫外分光光度儀進行定量和純度檢測，其余保存于-70℃ 冰箱中備用。抽取5 μl總RNA產物進行反轉錄，合成的DNA產物放于-20℃冰箱中保存。

1.4.2PCR反應：

①引物設計[6]：NMDA NR1：上游引物：5’GCAACCCTCACTTTTGAG3’下游引物：5’TGCAAAAGCCAGCTGCATCT3’；NMDA NR2A：上游引物：5’GACGGTCTTGGGATCTTAAC3’下游引物：5’TGACCATGAATTGGTGCAGG3’；②反應體系：10×PCR Buffer(無鎂)：5 μl；50 mmol/L MgCl2:3 μl；10 mmol/L dNTP:1μl；10 μmol/L sense primer:1 μl；10 μmol/L antisense primer:1 μl；Taq DNA聚合酶：0.4 μl；cDNA：2 μl；ddH2O：加至50 μl。擴增條件如下：反應條件： 95℃ 5min；95℃ 30 s；56℃ 45 s；72℃ 50 s；72℃ 10 min，共35個循環(huán)。RT-PCR后對其產物進行電泳，觀察其擴增片段位置并與Marker BM2000的各條帶位置進行比較，用凝膠成像系統(tǒng)測算電泳條帶的吸光度值。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 11.5軟件，采用配對t檢驗對灌流前后CAP閾值比較，采用單因素方差分析對各組NMDA NR1和 NMDA NR2A的mRNA量進行比較。

2 結果

2.1各組耳蝸灌流前后CAP閾值變化 灌流多巴胺可對4 000 Hz刺激聲引出的復合動作電位(CAP)產生明顯的抑制作用，使其閾值升高，以人工外淋巴液組耳蝸打孔前(即灌流前)的CAP閾值作為正常對照，除人工外淋巴液組外,其余三組灌流前后CAP閾值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。且這種抑制作用隨多巴胺濃度增大而增強，多巴胺濃度和CAP平均閾移之間具有明顯的濃度劑量依賴關系，Pearson相關系數(shù)為0.977(P<0.05)。

表1各組灌流前后4 kHz處CAP閾值(n=10耳)

注：*與同組灌流前比較，P<0.05

2.2RT-PCR的凝膠電泳結果 將取材后的耳蝸組織提取總RNA后，經光密度測定，各組標本OD260/OD280均在1.8～2.0之間，說明所提取的mRNA純度較好。正常對照組及各灌流組耳蝸中均有NMDANR1和NMDANR2A的表達(圖1)。

圖1 各組耳蝸中NMDA NR1和NMDA NR2A的mRNA的表達

a為NMDA NR1在各組中的表達：右側第一條帶為對照條帶，左側五個條帶為實驗條帶；b為NMDA NR2A在各組中的表達：左側第一條帶為對照條帶，右側五條帶為實驗條帶。a、b中從左至右依次為：①正常耳蝸組，②人工外淋巴液組，③10 mmol/L多巴胺組，④30 mmol/L多巴胺組，⑤50 mmol/L多巴胺組。右側箭頭標注的為Marker BM2000 的標準刻度條帶

2.3各組凝膠電泳條帶吸光度值比較 與正常對照組和人工外淋巴液組比較，不同濃度多巴胺灌流組NMDA NR1受體mRNA的吸光度值均明顯減小(P<0.05)，對照組與人工外淋巴液組之間其光度值差異無統(tǒng)計學意義；而各組間NMDA NR2A受體mRNA的吸光度值差異均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著灌流多巴胺濃度的增加，耳蝸中NMDA NR1的mRNA表達的量逐漸減少，即NMDA NR1的量逐漸減少，呈現(xiàn)明顯的濃度劑量依賴關系；而隨著灌流多巴胺濃度的增加，NMDA NR2A的量沒有明顯的變化(表2)。

表2 各組NMDA NR1和NMDA NR2A的mRNA相對含量(n=10耳)

注：*與正常對照組及人工外淋巴液組比較及兩兩之間比較，P<0.05

3 討論

多巴胺從外側橄欖耳蝸束釋放[7]，對噪聲、缺氧、耳毒性藥物具有抑制作用，從而對耳蝸起到保護性作用[8～10]。有證據表明耳蝸傳出神經對傳入神經末梢具有緊張性抑制作用[11]。Oestreicher[12]等應用微離子電滲療法對多巴胺及其D1、D2受體的生理作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)單獨應用多巴胺時，對傳入神經的自發(fā)性放電無影響，相反，對由谷氨酸NMDA和AMPA受體介導的傳入神經的放電，多巴胺卻有一種劑量依賴性的抑制作用。當應用多巴胺D1或D2受體激動劑時，也會產生類似的效應。多巴胺的這種抑制作用可被多巴胺D1或D2受體拮抗劑所阻斷[13]。由此表明多巴胺對傳入神經放電的抑制作用可以通過多巴胺D1或D2兩種受體亞型來介導。

采用人工外淋巴耳蝸灌流方法建立的動物模型，可避開各種屏障，能在體直接給藥，獲得常規(guī)方法包括離體細胞培養(yǎng)方法難以取得的真實可靠的結果。有研究證明對豚鼠耳蝸灌流人工外淋巴液2小時前后，其耳蝸CAP閾值及掃描電鏡觀察內、外毛細胞形態(tài)結構均沒有明顯變化，提示灌流人工外淋巴液對耳蝸形態(tài)結構無明顯影響。本實驗中觀察到在豚鼠耳蝸鉆孔前后及灌流人工外淋巴液前后CAP閾值沒有明顯變化，與以往研究相符，證明人工外淋巴液耳蝸灌流是一種切實可行的實驗方法，而且對豚鼠的耳蝸功能沒有明顯的影響。

個體發(fā)育成熟后，聽覺系統(tǒng)的神經元仍然具有很強的可塑性，有研究表明在大鼠耳蝸內使用電刺激2小時后，神經元通過改變基因表達模式而發(fā)生反應，這些細胞可以表達所謂的即時早期基因[也稱為立早基因(immediate early genes,IEGs)][14]。從本研究結果看，全耳蝸灌流不同濃度多巴胺2小時后，谷氨酸受體mRNA的表達量確有變化，與上述研究結果基本相符。由于本實驗在灌流過程中需要同時檢測動物的耳蝸電圖以觀察耳蝸功能的變化，因此沒有在記錄CAP的同時觀察耳蝸灌流多巴胺后不同時間點的谷氨酸受體mRNA量，推測其表達的量也可能會隨時間變化而有不同。

本實驗結果證明多巴胺的作用與NMDANR1含量呈現(xiàn)明顯的相關性，且NMDA NR1的量與灌流多巴胺的濃度呈現(xiàn)明顯的濃度劑量依賴關系。說明灌流多巴胺的濃度增加時，耳蝸中NMDA NR1受體的量逐漸減少，谷氨酸的作用降低，Ca2+和Na+內流的量減少，聽神經的動作電位減弱，聽覺傳入通路受到抑制。由于多巴胺的抑制作用主要和D2受體有關，所以推測多巴胺通過D2受體來調節(jié)NMDA NR1的量，最終起到抑制作用，但具體通過哪些途徑來實現(xiàn)這一調節(jié)作用還有待進一步探討。推測多巴胺可能競爭性地結合谷氨酸受體，使能與谷氨酸結合的谷氨酸受體量減少，從而使傳入突觸中谷氨酸的作用減弱，最終對傳入通路起到抑制作用。最近有學者證實了多巴胺通過D1受體來調節(jié)GluR1的磷酸化并最終實現(xiàn)其興奮性作用[5，15]。多巴胺的作用可能還與其他谷氨酸受體相關，而且多巴胺在內毛細胞下突觸復合體中的調控作用最終很可能就是通過調節(jié)谷氨酸及其受體的作用來實現(xiàn)的。

本實驗可見，隨著灌流多巴胺濃度的增加，NMDA RN2A的量沒有明顯的變化，說明多巴胺的抑制作用與NMDANR2A無關，也進一步說明多巴胺的抑制作用可能只與部分谷氨酸受體有關。因此，還須通過進一步的實驗來證實哪些谷氨酸受體與多巴胺有關，哪些谷氨酸受體與多巴胺無關，應用更精確的實驗技術來確定多巴胺和谷氨酸受體在相互作用時具體量的變化，并闡明這些相關的受體的具體作用機制，這對進一步認識多巴胺的作用機制、外側橄欖耳蝸束的功能以及整個聽覺傳導通路的功能具有十分重要的意義。

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