先天性巨結(jié)腸乳鼠模型的建立和評價

王玲朝 王春暉 江 遜 林 燕 王寶西

先天性巨結(jié)腸(hirschsprung＇s disease，HD)是病變結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如的一種腸道發(fā)育畸形,其病因尚未闡明[1]，目前認(rèn)為是遺傳及環(huán)境多種因素綜合所致[2]。HD發(fā)病率約為1/5 000，男∶女為4∶1。HD主要病理改變?yōu)椴∽兘Y(jié)腸段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，病變結(jié)腸持續(xù)性痙攣、狹窄，近端腸腔擴張，內(nèi)容物潴留。HD新生兒可表現(xiàn)為胎糞排出延遲和腸梗阻等癥狀，嬰兒及成人可表現(xiàn)為嚴(yán)重的便秘和腹脹，常合并小腸結(jié)腸炎、低位性腸梗阻，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量甚至危及生命[2～4]。

由于直接進(jìn)行人體研究受到倫理學(xué)限制，Sato等[5]于1978年首先用苯扎氯銨(BAC)選擇性損毀鼠腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成功建立大鼠巨結(jié)腸模型，之后該模型被廣泛應(yīng)用于損毀神經(jīng)方面的研究。Yoneda等[6]于2002年用BAC建立了小鼠巨結(jié)腸模型。目前應(yīng)用于HD研究的動物模型有花斑致死鼠和致死斑點鼠[7]，該模型與人類HD的病理學(xué)改變非常相似，但其培育困難，早期常死于嚴(yán)重的小腸結(jié)腸炎，存活時間短，不利于長期觀察研究。既往用BAC建立的大鼠和小鼠模型，是在大鼠和小鼠腸道神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育健全的基礎(chǔ)上建立的，不符合HD的發(fā)病微環(huán)境。6～7日齡乳鼠腸道神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚不健全且接近于胚胎時期[8]，用6～7日齡乳鼠建立的模型更接近于HD的發(fā)病微環(huán)境。本研究以乳鼠制備HD模型，并進(jìn)行模型評價，為進(jìn)一步深入研究HD及其相關(guān)并發(fā)癥的病因、病理機制、生理機制、病程演變特征及以Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)為靶點治療HD奠定實驗基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 動物和試劑 6～7日齡SD乳鼠9窩，每窩10只[由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(陜)2008-002]，乳鼠由母鼠喂養(yǎng)，母鼠采用二級鼠料喂養(yǎng)，動物飼養(yǎng)和實驗均遵照第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物飼養(yǎng)與使用規(guī)定。主要試劑：BAC(Sigma公司)；兔抗大鼠S-100蛋白多克隆抗體、兔抗大鼠NSE多克隆抗體、兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體和羊抗兔FITC-IgG(均購自Boster公司)。

1.2 分組和HD模型建立 將9窩乳鼠從1～9編號，從隨機數(shù)字表第5行第8列開始依次讀取1位數(shù)作為隨機數(shù)，錄于編號下，將全部隨機數(shù)從小至大編序號，規(guī)定序號1～3為實驗組，4～6為對照組，7～9為正常組，各組均為3窩。實驗組術(shù)前將4～5日齡SD乳鼠在第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d。乙醚麻醉，在無菌條件下行下腹部正中切口，提取降結(jié)腸(圖1)，在其腸系膜的無血管區(qū)，將0.1%BAC溶液浸泡過的濾紙條(0.8 cm×1 cm)緊貼腸壁環(huán)形包繞結(jié)腸1周，每5 min滴加0.1%BAC溶液100 μL于濾紙上，保持濾紙濕潤。15 min后移去濾紙條，用溫生理鹽水棉球蘸洗結(jié)腸及腹腔，回納腸管，絲線縫合關(guān)腹。對照組用生理鹽水代替0.1%BAC溶液處理降結(jié)腸15 min，操作同實驗組。正常組不做任何處理。術(shù)后母鼠喂養(yǎng)，每籠1窩分籠飼養(yǎng)。

圖1 先天性巨結(jié)腸制備外觀模型

Fig 1 Hirschsprung's disease neonatal rat model

Notes Neonatal rat abdominal midline incision to show descending colon

1.3 模型評價 術(shù)后每周觀察乳鼠生活習(xí)性、飲食、排便情況及有無腹脹。術(shù)后1、3、5、6和7周每組任意取4只乳鼠處死，實驗組取BAC處理段結(jié)腸，對照組取生理鹽水處理段結(jié)腸，正常組取遠(yuǎn)端結(jié)腸，生理鹽水沖洗腸腔，觀察各組結(jié)腸大體形態(tài)。

組織病理學(xué)檢查：各組結(jié)腸沿腸系膜緣縱行剪開，在濾紙上將腸壁展開，固定和編號。腸管用10%甲醛緩沖液固定24 h后取材。石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。光鏡下觀察各組結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病理學(xué)改變。

免疫組化檢測：以SABC法檢測各組結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞S-100蛋白和神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，組織抗原微波修復(fù)(檸檬酸鹽修復(fù)液)正常羊血清封閉，滴加兔抗大鼠S-100蛋白多克隆抗體(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS液沖洗3次，每次2 min，滴加SABC試劑，37℃孵育20 min，PBS洗5 min，共4次，使用DAB顯色試劑盒，取1 mL蒸餾水，加入試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間為20 min，蒸餾水洗滌。用PBS代替一抗作陰性對照。NSE的檢測方法同S-100蛋白。

免疫熒光檢測：以c-Kit免疫熒光檢測各組結(jié)腸ICC的分布和表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，組織抗原微波修復(fù)(檸檬酸鹽修復(fù)液)正常羊血清封閉。滴加兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS液沖洗3次，每次5 min。再滴加羊抗兔FITC-IgG(1∶200)，37℃孵育1 h，PBS液沖洗3次，每次5 min。甘油封片，用PBS代替一抗作陰性對照，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

實驗組乳鼠死亡5只，其中術(shù)后1 h被母鼠啃食2只，術(shù)后1 d腸管被BAC腐蝕死亡1只，術(shù)后3 d感染死亡1只，7周后腸穿孔死亡1只。對照組乳鼠術(shù)后1 h被母鼠啃食1只。正常組乳鼠無死亡。

2.1 一般情況和大體結(jié)腸形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)后1～3周實驗組和對照組乳鼠手術(shù)傷口愈合良好，吃奶及糞便正常，正常組未見異常表現(xiàn)。實驗組：術(shù)后4周3只出現(xiàn)腹脹；術(shù)后5周10只出現(xiàn)腹脹，排便減少，糞便顆粒性狀改變不明顯；術(shù)后6周12只出現(xiàn)腹脹，排便減少，較對照組和正常組糞便顆粒變大。

處死后大體解剖可見BAC處理段結(jié)腸狹窄。術(shù)后7周實驗組均出現(xiàn)不同程度的排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，糞便顆粒較對照組和正常組干燥且明顯變大，處死后大體解剖可見BAC處理段結(jié)腸腸管狹窄、痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內(nèi)容物潴留(圖2)。對照組和正常組結(jié)腸未見明顯異常。

圖2 實驗組術(shù)后7周大體解剖BAC處理段結(jié)腸所見

Fig 2 Autopsy of experimental rats 7 weeks after BAC treatment

Notes 7 weeks after BAC treatment，a narrowed segment at the site of BAC treatment，accompanied by distended proximal colon filled with massive feces

2.2 病理學(xué)檢查結(jié)果 正常組遠(yuǎn)端結(jié)腸和對照組生理鹽水處理段結(jié)腸可見正常的肌間及黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，正常組見圖3A。實驗組術(shù)后1、3周BAC處理段結(jié)腸肌間及黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與對照組比較減少不明顯(圖3B,C)，術(shù)后5、6周可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少、體積逐漸變小(圖3D,E)，術(shù)后7周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞完全消失，腸壁其他結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)現(xiàn)瘢痕形成及炎癥細(xì)胞浸潤(圖3F)。

圖3 正常組和實驗組結(jié)腸組織病理學(xué)檢查(蘇木精-伊紅染色，×100)

Fig 3 Pathology of normal and experimental group rats(HE，×100)

Notes A：Normal ganglion cells of the normal group；B：1 week after BAC treatment，ganglion cells had no significant changes；C：3 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased；D：5 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased in the number and the size；E：6 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased obviously in the number and the size；F： 7 weeks after BAC treatment，ganglion cells in the myenteric and submucous plexuses completely disappeared

2.3 S-100蛋白和NSE的表達(dá) 正常組遠(yuǎn)端結(jié)腸和對照組生理鹽水處理段結(jié)腸S-100蛋白表達(dá)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中，兩組差異不明顯，正常組見圖4A。實驗組術(shù)后1、3周BAC處理段結(jié)腸肌間及黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞S-100蛋白的表達(dá)與對照組比較減少不明顯(圖4B,C)，術(shù)后5、6周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)逐漸減少、神經(jīng)節(jié)體積逐漸變小(圖4D,E)，術(shù)后7周S-100蛋白表達(dá)完全消失(圖4F)。

圖4 S-100蛋白在正常組和實驗組結(jié)腸組織的表達(dá)(免疫組化，×100)

Fig 4 The expression of S-100 protein in normal and experimental group rats(immunohistochemistry，×100)

Notes A：Normal ganglion cells appeared as brown particles in the normal group；B：1 week after BAC treatment，ganglion cells had no significant changes；C：3 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased；D：5 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased in the number and the size；E：6 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased obviously in the number and the size；F：7 weeks after BAC treatment，ganglion cells completely disappeared

正常組遠(yuǎn)端結(jié)腸和對照組生理鹽水處理段結(jié)腸組織NSE表達(dá)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞核中，兩組表達(dá)差異不明顯,正常組見圖5A。實驗組術(shù)后1、3周BAC處理段結(jié)腸肌間及黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NSE的表達(dá)與對照組比較無明顯改變(圖5B,C)，術(shù)后5、6周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NSE表達(dá)逐漸減少、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體積逐漸變小(圖5D,E)，術(shù)后7周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NSE表達(dá)完全消失(圖5F)。

圖5 NSE在正常組和實驗組結(jié)腸組織的表達(dá)(免疫組化，×100)

Fig 5 The expression of NSE in normal and experimental group rats(immunohistochemistry，×100)

Notes A：Normal ganglion cells appeared as brown particles in the normal group；B：1 week after BAC treatment，ganglion cells had no significant changes；C：3 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased；D：5 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased in the number and the size；E：6 weeks after BAC treatment，ganglion cells decreased obviously in the number and the size；F：7 weeks after BAC treatment，ganglion cells completely disappeared

2.4 免疫熒光檢測c-Kit的表達(dá) 正常組遠(yuǎn)端結(jié)腸和對照組處理段結(jié)腸ICC的分布和形態(tài)相似，差異不明顯，ICC在切面上幾乎呈現(xiàn)連續(xù)性分布，相互連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，正常ICC多呈紡錘形，有2～3條突起，正常組ICC的分布和形態(tài)見圖6A。術(shù)后1周實驗組BAC處理段結(jié)腸c-Kit的表達(dá)與正常組較為接近(圖6B)，術(shù)后3、5、6和7周c-Kit的表達(dá)逐漸減少，提示ICC在BAC處理段結(jié)腸的分布明顯減少，ICC分布均較對照組和正常組明顯減少，網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，形態(tài)也出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為突起變短、變鈍(圖6C～F)。

圖6 正常組和實驗組結(jié)腸組織c-Kit的表達(dá)(免疫熒光, ×200)

Fig 6 The expression of c-Kit in normal and experimental group rats(immunofluorescence，×200)

Notes A：Normal ICC of normal group； B：ICC 1 week after BAC treatment had no significant changes；C：ICC 3 weeks after BAC treatment decreased，D：ICC 5 weeks after BAC treatment decreased obviously，the network was disappeared；E：ICC 6 weeks after BAC treatment decreased obviously，the network was disappeared，and the configuration was abnormal；F：ICC 7 weeks after BAC treatment，decreased obviously，the network was disappeared，and the configuration was abnormal，the ICC got blunted and short processes

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，HD與ICC的減少有密切關(guān)系[9]。Rolle等[10]發(fā)現(xiàn)HD患者結(jié)腸腸管的肌間ICC比正常對照組顯著減少。王寶西等[11]研究發(fā)現(xiàn)ICC分布減少和形態(tài)異常可導(dǎo)致HD的發(fā)生。HD患兒由于病變結(jié)腸腸壁缺少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞使腸壁痙攣、腸腔狹窄，使糞便滯留在近端結(jié)腸，該段腸管繼發(fā)性擴張、肥厚，形成巨結(jié)腸。因此選擇性損毀結(jié)腸肌間及黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是制備HD動物模型的理論依據(jù)。BAC選擇性損傷腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的機制可能是BAC長分子鏈與神經(jīng)軸突膜活性基團多個位點結(jié)合并注入膜內(nèi)，引起膜腫脹，離子自由進(jìn)入膜內(nèi)，進(jìn)而引起膜的去極化，導(dǎo)致動作電位和靜息電位快速和不可逆地減小。當(dāng)BAC作用于結(jié)腸壁時，膜電位比平滑肌細(xì)胞低的神經(jīng)細(xì)胞易受到損傷，從而選擇性地?fù)p傷神經(jīng)細(xì)胞，而不損傷其他細(xì)胞組織[12]。中國學(xué)者也用該方法成功地建立了成年動物HD模型[13～15]，但各研究中BAC濃度、作用時間、作用腸段長度，模型完成所需時間及所采用動物有所不同。本研究采用0.1%BAC作用在1 cm的乳鼠結(jié)腸段15 min，術(shù)后7周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞完全消失，提示模型建立成功。

在預(yù)實驗中術(shù)后乳鼠存活率僅為50%，多在術(shù)后3 d內(nèi)死亡，主要原因為：人為的異味及血跡造成母鼠啃食乳鼠；手術(shù)不熟練致使乳鼠手術(shù)損傷加重；術(shù)后乳鼠對新環(huán)境不適應(yīng)；術(shù)中和術(shù)后乳鼠體溫降低；清洗腹腔不徹底使BAC腐蝕乳鼠腹腔其他臟器；術(shù)后切口感染等。通過總結(jié)，采取術(shù)前乳鼠在飼養(yǎng)室適應(yīng)1～2 d新環(huán)境；熟練手術(shù)步驟，做到快、準(zhǔn)、輕和細(xì)，盡量減少對乳鼠的創(chuàng)傷；盡量減少BAC滲入腹腔；術(shù)中和術(shù)后加強對乳鼠保暖；術(shù)后給乳鼠體表涂抹適量母鼠尿液，覆蓋人為異味；術(shù)中嚴(yán)格無菌操作，術(shù)后切口涂適量青霉素粉劑預(yù)防感染等措施使乳鼠存活率明顯提高。

本研究發(fā)現(xiàn)ICC在實驗組和對照組的分布、數(shù)量和形態(tài)上均有差異。實驗組術(shù)后3～7周ICC的數(shù)量明顯減少，殘存ICC突起變短、變鈍，連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，與HD患兒結(jié)腸狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和ICC改變的特點相一致[16]。ICC是一種特殊類型的間質(zhì)細(xì)胞，廣泛分布于消化道，是胃腸慢波活動的起搏器和傳導(dǎo)細(xì)胞，也是腸神經(jīng)作用的首要靶細(xì)胞[17]。ICC的基因表達(dá)產(chǎn)物c-Kit對于ICC表型的發(fā)育和維持是必需的，因此c-Kit成為胃腸道ICC的特異性標(biāo)志物?？杀磉_(dá)于ICC、肥大細(xì)胞及造血細(xì)胞等多種細(xì)胞[18]。在胃腸道組織中只有ICC和肥大細(xì)胞表達(dá)c-Kit，從而有較高的特異性[19]，c-Kit 受體被廣泛用于胃腸道ICC的鑒定[20]。肥大細(xì)胞數(shù)量很少，且其細(xì)胞形態(tài)很容易和ICC區(qū)分[21]，因此，本研究應(yīng)用c-Kit特異性抗體和形態(tài)學(xué)的方法鑒定ICC，c-Kit表達(dá)減少，提示ICC的減少。

本研究用6～7日齡乳鼠成功建立HD模型，模型建立后實驗組乳鼠出現(xiàn)排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，體重減輕，糞便顆粒變干和變大。大體解剖發(fā)現(xiàn)BAC處理段腸管狹窄、痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內(nèi)容物潴留。NSE和S-100蛋白表達(dá)逐漸減少至消失，表明神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逐漸減少至消失，c-Kit的表達(dá)逐漸減少；提示模型建立成功。

本研究的不足之處和局限性：①技術(shù)方法不完善，未能使用免疫組化雙標(biāo)及多標(biāo)術(shù)使各組的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、ICC共同顯色，以使結(jié)果更嚴(yán)謹(jǐn)和直觀；②未從分子生物學(xué)方面研究模型的特性。

[1]Zhou MN(周妙妮)，Zhang CN，Li JC．Research progress of molecular genetic pathogenesis of Hirschsprung disease．International Journal of Genetics(國際遺傳學(xué)雜志)，2007，30(3)：217-220

[2]de Lorijn F, Boeckxstaens GE, Benninga MA. Sympto-matology，pathophysiology，diagnostic work-up，and treatment of Hirschsprung＇s disease in infancy and childhood．Curr Gastroenterol Rep，2007，9(3)：245-253

[3]Chen F, Winston JH, Jain SK, et al．Hirschsprung′s disease in a young adult: report of a case and review of the literature. Ann Diagn Pathol，2006，10(6)：347-351

[4]Kessmann J．Hirschsprung＇s disease：diagnosis and management．Am Fam Physician，2006，74(8)：1319-1322

[5]Sato A，Yamamoto M，Imamura K，et al．Pathophysiology of aganglionic colon and anorectum：an experimental study on a ganglionosis produced by a new method in the rat．J Pediatr Surg，1978，13(4)：399-435

[6]Yoneda A, Shima H, Nemeth L, et al．Selective chemical ablation of the enteric plexus in mice．Pediatr Surg Int，2002，18(4)：234-237

[7]Robertson K, Mason I, Hall S. Hirschsprung′s disease: genetic mutations in mice and men. Gut，1997，41(4)：436-441

[8]Burns AJ, Roberts RR, Bornstein JC, et al．Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility during fetal and early postnatal stages．Semin Pediatr Surg, 2009, 18(4):196-205

[9]Hou Y(侯豫)，Yang Y，Zhao X，et al．Expression of glial cell derived neurotrophic factor in Hirschsprung′s disease．J Appl Clin Pediatr(實用兒科臨床雜志),2008,23(7)：507-509

[10]Rolle U, Piotrowska AP, Nemeth L, et al．Altered distribution of interstitial cells of Cajal in Hirschsprung disease. Arch Pathol Lab Med，2002，126(8)：928-933

[11]Wang BX(王寶西)，Hou Y，Yang Y．Expression and distribution of glial cell derived neurotrophic factor，interstitial cells of Cajal and Connexin 43 in Hirschsprung′s disease．Chin J Evid Based Pediatr(中國循證兒科雜志)，2009，11(3)：333-339

[12]Levin RJ．Actions of spermicidal and virucidal agents on electrogenic ion transfer across human vaginal epithelium in vitro．Pharmacol Toxicol，1997，81(5)：219-225

[13]Xu JR(徐紀(jì)榮)，Jing XQ，Chen XZ．Establishment of experimental aganglionosis model and observation of its biological features in rat．Journal of Chongqing Medical University (重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報)，2005，30 (4)：594-597

[14]Liu W(劉偉)，Wu RD，Dong YL，et al．An animal model of aganglional megacolon．Chin J Pediatr Surg(中華小兒外科雜志)，2007，28(4)：208-210

[15]Shu XG(舒曉剛)，Chen JB，Wang GB，et al．Establishment and biological characteristics of aganglionosis mouse model．Chin J Exp Surg (中華實驗外科雜志)，2008，25(5)：671-672

[16]Rumessen JJ．Ultrastructure of interstitial cells of Cajal at the colonic submuscular border in patients with ulcerative colitis．Gastroenterology，1996，111(6)：1447-1455

[17]Seki K，Komuro T．Immunocytochemical demonstration of the gap junction proteins connexin 43 and connexin 45 in the musculature of the rat small intestine．Cell Tissue Res，2001，306(3)：417-422

[18]Luo M(羅曼)，Li HF．Expression of c-Kit tyrosine receptor and intercellular adhesion molecule-1 in endometriosis．China Journal of Modern Medicine(現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志)，2008，18(11)：1571-1574

[19]Streutker CJ, Huizinga JD, Driman DK, et al．Interstitial cells of Cajal in health and disease．Part I：Normal ICC structure and function with associated motility disorders．Histopathology，2007，50(2)：176-189

[20]Vannucchi MG．Receptors in interstitial cells of Cajal: identification and possible physiological roles.Microsc Res Tech，1999，47(5)：325-335

[21]Yan JA(鄢俊安)，Song B．Research on ICC-like Cells of Bladder．Progress in Modern Biomedicine(現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展)，2009，9(3)：598-600