實時熒光定量PCR檢測宮頸癌患者血漿HPV的臨床意義

邵 佳， 陳曾燕， 王 潔， 馬 蓉

宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，它在導致女性死亡的惡性腫瘤中占第二位，僅次于乳腺癌。據(jù)世界范圍內的統(tǒng)計，每年大約有50萬新發(fā)的宮頸癌病例，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國宮頸癌患病率和病死率均約占世界的1/3，每年新增宮頸癌患者13.15萬，約有5萬例死于宮頸癌。臨床和流行病學研究結果表明，宮頸癌的發(fā)生可能與某些病毒感染相關，其中人乳頭瘤病毒(HPV) 感染被認為是宮頸癌發(fā)生的早期事件之一[1]。

HPV是一種小的雙鏈DNA病毒，可以特異性地感染人皮膚黏膜的鱗狀上皮細胞, 引起多種良、惡性病變。其中HPV16和HPV18是致癌高危因子。近年來，國外越來越多的報道開始研究宮頸癌患者外周血中的HPV DNA，認為其不僅僅是診斷指標，更有可能成為腫瘤復發(fā)與轉移的預后判斷指標[2-3]。

本研究應用實時熒光定量基因擴增技術對宮頸癌初診患者外周血中HPV DNA進行檢測分析，不僅為宮頸癌HPV感染的研究提供新的方法，還進一步評價了HPV DNA在宮頸癌早期診斷、臨床分期中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年6月—2009年5月在我院住院治療，經病理檢查確診為宮頸腫瘤患者150例，其中癌前病變(CIN)10例，宮頸浸潤癌140例(臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期54例，Ⅲ期54例，Ⅳ期5例)，平均年齡48歲，所有患者收治前均未進行任何治療。另收集35例非宮頸疾病導致的子宮切除患者作為正常對照組，平均年齡45歲。

1.2 標本收集和DNA抽提 收集兩組患者宮頸活檢組織(約25 mg)和EDTA抗凝外周血3 mL。2000 rpm離心分離上層血漿，每份血漿樣品取50 μL備用，余-20℃凍存。采用試劑盒分別抽提患者組織和血漿DNA(QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp Blood Kit，QIAGEN，Germany)，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.3 基因擴增與分型 宮頸活檢組織HPV DNA擴增選用針對HPV L1保守基因片段的改良通用引物PGMY09/11，引物的5′端用生物素進行標記。PGMY09：5′-biotin-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′；PGMY11：5′-biotin-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′(M=A/C，W=A/T，Y=C/T，R=A/G)。

基因分型檢測按照試劑盒說明書(人乳頭瘤病毒基因分型檢測試劑盒，深圳亞能生物技術有限公司)，采用PCR-反向點雜交法，經DNA擴增、雜交、洗膜、顯色、讀取結果，檢測宮頸活檢組織HPV亞型。

1.4 real-time qPCR檢測 按照參考文獻[4]，將已知濃度(107 copies/mL)的HPV 16、18質粒10倍濃度稀釋成標準品，-20℃保存?zhèn)溆谩７謩e合成real-time qPCR上下游引物、探針(表1)。每批PCR均設陰性對照(雙蒸水)，不加模板空白對照和5個標準品對照(105、104、103、102、101 copies/mL)對照。

表1 HPV16,18引物及探針序列

PCR反應體系：總反應體系20 μL，包括5 μL樣品DNA，1×PCR buffer，200 μM dNTPs，各0.4 μM PCR上下游引物，0.1 μM探針，5 mM MgCl2和1U DNA聚合酶(AmpliTaq Gold DNA polymerase，ABI，USA)。

PCR擴增條件：將混合好的PCR反應液在ABI-7300熒光定量PCR儀上進行基因擴增檢測，95℃預變性15 min后，以95℃變性10 s, 60℃延伸1 min擴增45個循環(huán)。

根據(jù)標準品建立標準曲線，由ABI-7300系統(tǒng)軟件自動計算待測樣品中HPV16、18 DNA拷貝含量。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析，應用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸活檢組織中HPV感染率 在150例宮頸癌患者宮頸活檢組織樣本中，采用改良通用引物PGMY09/11檢出HPV陽性病例142例，陽性感染率94.7%，其中癌前病變9例(6.3%)，宮頸浸潤癌133例(93.7%)。在35例正常對照組中發(fā)現(xiàn)3例(8.6%)HPV DNA陽性。

2.2 宮頸活檢組織中HPV亞型的分布 在142例不同程度病變宮頸組織中共檢出12種HPV亞型，包括HPV16(66.9%)95例， HPV18(14.8%)21例， HPV45(5.6%)8例， HPV31、HPV52(2.8%)各4例，HPV51、58、73(1.4%)各2例，HPV33、56、79、68(0.7%)各1例。在3例對照組中，2例感染HPV18，1例感染HPV31。

2.3 血漿中HPV16陽性檢出率 95例宮頸活檢組織HPV16陽性患者中，有55例血漿中發(fā)現(xiàn)HPV16 DNA，陽性率57.9%，病毒含量11～32 469 copies/mL，中位數(shù)為372 copies/mL。宮頸癌臨床各期患者血漿HPV16陽性檢出情況分別為：CIN 1例(16.7%)，Ⅰ期4例(21.1%)，Ⅱ期20例(64.5%)，Ⅲ期28例(75.7%)，Ⅳ期2例(100%)。統(tǒng)計學分析提示宮頸癌臨床分期與血漿病毒檢出率顯著相關(P<0.001，表2)，與病毒拷貝數(shù)無相關(P=0.277)。對照組血漿中未檢出HPV DNA。

表2 血漿HPV16 DNA的檢測情況

2.4 血漿中HPV18陽性檢出率 5例宮頸癌患者血漿中HPV18 DNA顯示陽性(5/21，23.8%)，病毒含量177～4 936 copies/mL，中位數(shù)480 copies/mL。宮頸癌臨床各期患者血漿HPV18 DNA擴增結果見表3，統(tǒng)計學分析表明宮頸癌臨床分期與血漿病毒檢出率和病毒拷貝數(shù)均無相關(P=0.609，P=0.512)。

表3 血漿HPV18 DNA的檢測情況

3 討論

HPV感染是宮頸癌和宮頸上皮內瘤變的必要因素。目前已經發(fā)現(xiàn)200多種不同亞型的HPV，約有30種可以感染生殖道。根據(jù)其致病性差異可分為低危型HPV(如6、11、42、43、44 型)和高危型HPV(如16、18、31、33、39、45、51、52、58、59、68 型)。低危型HPV主要導致尖銳濕疣,而高危型HPV的持續(xù)感染被認為是宮頸癌發(fā)生的重要原因[5]。國際癌癥研究中心對10 058例宮頸癌患者進行的研究表明，HPV亞型按照感染力的高低依次為HPV16、18、45、31、33、58、52、35、59，其中HPV16占51.0%，HPV18占16.2%，可見HPV16、18與宮頸癌發(fā)生的關系尤為密切。

近年來，隨著腫瘤分子生物學研究的進展，循環(huán)血游離DNA的檢測及其生物學指標的研究，將有可能為臨床腫瘤的早期診斷、預后判定及跟蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無創(chuàng)或微創(chuàng)和分子生物學檢測手段[6]。循環(huán)DNA是一種無細胞狀態(tài)的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質復合物或游離DNA兩種形式存在。早在1947年Mandel和Metais就發(fā)現(xiàn)了循環(huán)核酸；30年后Leon等人的研究表明腫瘤患者外周血清DNA水平大大高于正常人；1989年Stroun等發(fā)現(xiàn)血液游離DNA具有腫瘤細胞DNA的一些特征；5年后研究者在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到了癌基因突變，并且與原發(fā)腫瘤相一致。2000年，Lo等[7]用實時熒光定量PCR在鼻咽癌患者血漿中檢出EBV DNA，隨后大量的研究證實血漿EBV DNA含量的變化與鼻咽癌的復發(fā)和轉移相關，提示其可能成為鼻咽癌診斷、治療、預后判斷的指標之一。

EBV的研究引發(fā)了人們對于血漿HPV DNA的思考。2004年，Yang等[4]報道了約有50%的宮頸癌初診患者血漿HPV16 DNA陽性，而在宮頸組織HPV16陽性的患者中，血漿HPV16 DNA的檢出率達到64.3%。同樣，Duenas等[8]的研究發(fā)現(xiàn)70%的患者血漿中含有HPV DNA，治療后明顯降低。然而，Pornthanakasem等[9]卻認為僅有12%的宮頸組織HPV陽性患者能夠檢出血漿HPV DNA。Dong等[10]隨機檢測了175例宮頸癌患者，結果治療前血漿HPV16 DNA陽性率9.6%，治療后下降為5.7%。

不同的實驗結果可能與研究人群，樣本采集，操作方法、技術和統(tǒng)計方式的不同有關。本實驗采用熒光定量PCR方法對宮頸癌初診患者進行了血漿HPV DNA檢測，結果HPV16、18的陽性率分別為57.9%、23.8%，而正常對照組未檢出，提示了該技術檢測血漿HPV DNA的可行性，為宮頸癌HPV感染的研究提供了數(shù)據(jù)參考。值得注意的是，在對HPV16的研究中，我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌臨床分期與血漿病毒檢出率顯著相關(P<0.001)，這可能是因為血漿HPV16 DNA由腫瘤細胞釋放入外周血，隨著病期的發(fā)展，越來越多的病毒DNA被復制，提示血漿HPV16 DNA水平可能成為監(jiān)測宮頸癌轉移、復發(fā)的重要指標。同時，我們還分析了HPV16血漿病毒拷貝數(shù)與宮頸癌臨床病期的關系，結果顯示沒有統(tǒng)計學意義，推測可能與樣本量不足有關。尚須開展大樣本宮頸癌患者血漿HPV DNA動態(tài)變化的前瞻性觀察，以進一步明確該腫瘤標記物作為宮頸癌診斷試驗的敏感性和特異性，以及能否作為宮頸癌療效評定和預后判斷的獨立指標而應用于臨床。實驗中，由于HPV18陽性病例有限，我們未能進行大量樣本的檢測。因此，雖然結果未能證明血漿HPV18與宮頸癌相關，我們仍需進行臨床大量標本的血漿HPV PCR檢測。

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有一個由量變到質變、漸變到突變的過程, 這個過程可存在多年, 這是早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌及癌前病變的絕好時機。如果能在癌前病變階段被確診并進行治療和監(jiān)測, 可降低宮頸浸潤癌的發(fā)生率和死亡率。血漿HPV DNA的檢測對于預防宮頸癌，發(fā)現(xiàn)癌前病變，干預病程發(fā)展起到了積極的作用。

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