Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義

魏 玲， 李蘇宜， 曹蘇生

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，對其預(yù)后文獻(xiàn)報(bào)道不一，總的5年生存率為20%左右[1]。Bmi-1是多梳基因(PcG)家族成員，首次被提出是在1991年，Haupt等[2]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因鼠的淋巴瘤細(xì)胞傳代中，其作為一種原癌基因與另一種癌基因C-myc協(xié)同作用可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。bmi-1基因與腫瘤形成、預(yù)后的關(guān)系在國內(nèi)外正在逐步受到重視。但是，關(guān)于Bmi-1在食管癌組織中的表達(dá)研究，目前僅有國外的少量報(bào)道。本研究旨在通過免疫組化染色的方法，檢測Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)，以探討其與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集徐州市中心醫(yī)院2002年至2008年保存的食管癌石蠟標(biāo)本30例，所有病例均經(jīng)病理學(xué)確診為食管鱗癌。其中男性24例，女性6例，中位年齡59歲。根據(jù)TNM分期法,臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期的病例18例,Ⅲ期的病例12例；30例中有16例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,14例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋。

1.2 試劑與方法 每個(gè)蠟塊取4 μm厚連續(xù)切片做免疫組化染色。鼠抗人Bmi-1單克隆抗體購自英國Abcam公司,抗體稀釋液和二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉公司。

用免疫組化方法檢測食管鱗癌組織中Bmi-1的表達(dá)。先將切片置于二甲苯中脫蠟,乙醇梯度水化處理, 檸檬酸緩沖液抗原煮沸修復(fù),滴加鼠抗人Bmi-1(1∶50, 英國Abcam公司)，37℃孵育 1 h，滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,鹽酸乙醇固定,封片,觀察。用PBS代替一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 光學(xué)顯微鏡下觀察組織標(biāo)本的著色程度。Bmi-1蛋白陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。高倍鏡下(放大400倍)隨機(jī)取4個(gè)不同的視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核陽性細(xì)胞數(shù),按陽性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分:陽性細(xì)胞率≤10%為1分,陽性細(xì)胞率>10%而≤50%為2分,陽性細(xì)胞率>50%而≤75%為3分,陽性細(xì)胞率>75%為4分。同時(shí),根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度計(jì)分:陰性染色1分,弱染色2分,中等強(qiáng)度染色3分,強(qiáng)染色4分。根據(jù)二者的乘積判斷結(jié)果:≤4分為(-)，>4分而≤8分為(+)，>8分而≤12分為(++)，>12分而≤16分為(+++)。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)(-)和(+)合計(jì)為陰性表達(dá),(++)和(+++)合計(jì)為陽性表達(dá)。以上結(jié)果均至少由兩位病理科醫(yī)生以雙盲法觀察確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用R×C表Fisher′s Exact Test 進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達(dá) Bmi-1的陽性表達(dá)主要為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(見圖1)。30例食管鱗癌標(biāo)本中Bmi-1的陽性率為26.6%(8/30), 食管癌旁組織標(biāo)本中Bmi-1的陽性率為6.6%(2/30),可見 Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。

圖1 Bmi-1在食管癌組織中的陽性表達(dá)

2.2 Bmi-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Bmi-1蛋白高表達(dá)與食管鱗癌TNM分期、浸潤深度密切相關(guān),即Bmi-1蛋白在侵及肌層的食管鱗癌中的表達(dá)明顯低于在腫瘤侵及外膜的食管鱗癌中表達(dá); TNM分期中Ⅲ期的患者Bmi-1蛋白表達(dá)高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05),但與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān) (P>0.05)。(見表1)

表1 Bmi-1的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

人類bmi-1基因位于第10號(hào)染色體短臂13區(qū)(10p13)， Bmi-1蛋白與果蠅Psc和Su(z)2蛋白結(jié)構(gòu)相似，其氨基端為環(huán)指結(jié)構(gòu)域(ring finger domain，RF)，中間部分為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角(H-T-H-T-H-T)結(jié)構(gòu)，是DNA結(jié)合域，正是這兩個(gè)區(qū)域與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及腫瘤形成有關(guān)[2]。Bmi-1是一種廣泛表達(dá)的核蛋白, 參與干細(xì)胞的自我更新和維持，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，高表達(dá)的Bmi-l被認(rèn)為是腫瘤中存在的腫瘤干細(xì)胞。Dirks[3]報(bào)道，Bmi-1低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有較低的侵襲性，因?yàn)樗休^少的干細(xì)胞。最近一些研究[4]顯示Bmi-1 高表達(dá)時(shí)負(fù)性調(diào)控 p16INK4a 蛋白表達(dá), 使 p16INK4a 蛋白表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入 S 期，從而促使細(xì)胞的生長和增殖； Bmi-1 高表達(dá)還抑制 p19ARF，阻止細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。Bmi-1直接參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移。Bmi-1在血液系統(tǒng)惡性腫瘤及肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤中表達(dá)異常。Song等[5]研究證實(shí)Bmi-1在胰腺癌細(xì)胞株和胰腺癌組織中起正調(diào)節(jié)作用，Bmi-1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Bmi-1陽性表達(dá)者生存率低。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1蛋白過度表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Bmi-1陽性者的5年生存率明顯低于 Bmi-1陰性者，在多因素分析中 Bmi-1是影響生存率的因素，其表達(dá)上調(diào)是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志。對146例原發(fā)胃癌患者進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)[7], 免疫組化結(jié)果顯示有99例表達(dá)了Bmi-1, Bmi-1的過表達(dá)程度與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有高度相關(guān)性, 通過RT-PCR證明胃癌組織中Bmi-1的翻譯和轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)。作者認(rèn)為, Bmi-1可成為胃癌的診斷和獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一。日本兵庫醫(yī)學(xué)院Fujiwara等[8]的研究表明,對于食管鱗狀細(xì)胞癌患者,干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi-1表達(dá)陽性與新輔助放化療后早期復(fù)發(fā)及預(yù)后不良相關(guān), Bmi-1陽性提示食管癌預(yù)后不佳。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bmi-1在食管鱗癌旁組織中的表達(dá)低于鱗癌組織，與He等[9]報(bào)道的結(jié)果一致。Bmi-1蛋白表達(dá)在食管鱗癌旁組織和食管鱗癌組織中呈逐漸上調(diào)趨勢，食管鱗癌組織中存在Bmi-1蛋白高表達(dá)現(xiàn)象提示Bmi-1 蛋白與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。有研究表明Bmi-1蛋白的表達(dá)水平隨著腫瘤分化水平的降低而升高， 即其表達(dá)水平越高， 腫瘤的生物學(xué)行為越差[10]。本研究顯示Bmi-1蛋白高表達(dá)率與患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與TNM病理分期和浸潤深度相關(guān)。即 Bmi-1蛋白在侵及外膜的食管鱗癌的表達(dá)明顯高于侵及肌層者；TNM 分期中的Ⅲ期患者 Bmi-1 蛋白表達(dá)高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。以上結(jié)果提示食管鱗癌組織中 Bmi-1 蛋白高表達(dá)是判斷食管鱗癌患者預(yù)后不良的參考指標(biāo)之一。

本研究結(jié)果顯示Bmi-1 蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，這有兩種可能性，(1)Bmi-1的表達(dá)確實(shí)與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，(2)樣本例數(shù)不夠多。因此，有必要擴(kuò)大樣本量的研究，以進(jìn)一步證實(shí)這一論斷。另外，本研究還提示Bmi-1過表達(dá)在食管鱗癌的發(fā)生中可能具有重要意義，Bmi-1基因檢測的進(jìn)一步深入研究應(yīng)針對其作為預(yù)后分子靶標(biāo)、治療相關(guān)敏感性預(yù)測的價(jià)值做出判斷，進(jìn)而為治療提供新靶點(diǎn)。

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