FTO基因SNP rs9939609, rs1421085多態(tài)性與兒童青少年肥胖及其代謝指標(biāo)的相關(guān)性研究

曹凌峰 羅飛宏 支滌靜 程若倩 沈水仙 楊 毅

飲食和生活習(xí)慣等環(huán)境因素對肥胖的發(fā)生和發(fā)展起著十分關(guān)鍵的作用，但遺傳因素構(gòu)成了肥胖產(chǎn)生的內(nèi)在基礎(chǔ)。研究表明至少5%的肥胖兒童存在單基因的缺陷，而5%左右的肥胖存在復(fù)雜的多基因數(shù)量性狀效應(yīng)[1]。在FTO(fat-mass and obesity associated)基因研究中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)與肥胖及其代謝綜合征的關(guān)聯(lián)研究是近10多年的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，既往研究報(bào)道了很多肥胖易感基因SNP，如漿細(xì)胞膜糖蛋白1(ENPP1)基因、脂聯(lián)素(APM1)基因和轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)等，與BMI、胰島素抵抗和肥胖高度相關(guān)，但研究結(jié)果不盡一致，提示基因多態(tài)性的效應(yīng)存在人種和人群間的差異[2]。

在既往研究基因變異和肥胖及其相關(guān)代謝指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究中，一直沿用的基因組連鎖分析和候選基因策略雖然成功地確定了某些與肥胖相關(guān)的基因或基因變異，但僅有少數(shù)能在不同人群和人種中重現(xiàn)。主要的原因是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)欠缺，表型評估差異，基因標(biāo)記的選擇不一和研究樣本量的不同[3]。

全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)是在全基因組范圍內(nèi)選擇遺傳變異進(jìn)行基因分型, 比較病例和對照間每種變異頻率的差異, 計(jì)算變異與疾病的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度, 選出最相關(guān)的變異進(jìn)行驗(yàn)證并最終確認(rèn)與疾病相關(guān)。通過對SNP與不同癥狀的相關(guān)性研究，最終確定這些SNP對于特定疾病患病風(fēng)險(xiǎn)的影響[4]。GWAS研究不需要預(yù)先對特定關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行假設(shè)，因此主觀理論對研究結(jié)果影響較小。

在上海市科技攻關(guān)基金項(xiàng)目(024119013)的系列研究中，對AMP1基因SNP276和漿細(xì)胞膜糖蛋白1(K121Q)與肥胖和(或)超重的相關(guān)性進(jìn)行分析，采用的是國外候選基因策略所獲得的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)[5]，未發(fā)現(xiàn)這2個基因多態(tài)性與中國漢族兒童代謝指標(biāo)的相關(guān)性，可能與上述原因有關(guān)。而本文采用的是基于國外GWAS研究策略所獲得的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，以了解FTO基因SNP rs9939609、 rs1421085多態(tài)性與中國漢族兒童青少年單純性肥胖及代謝指標(biāo)間的相關(guān)性，為今后類似研究提供方法學(xué)選擇的借鑒。

1 方法

1.1 研究對象、人體指標(biāo)測量、代謝指標(biāo)檢測、基因分型和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 FTO基因SNP rs9939609、 rs1421085多態(tài)性的研究人群(納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)、正常對照組的設(shè)計(jì)，倫理和知情同意)，空腹血糖受損的判斷方法，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、胰島素敏感指數(shù)(QUICKI)的計(jì)算方法， DNA抽提方法，人體指標(biāo)測量數(shù)據(jù)、一般資料數(shù)據(jù)、代謝指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法均與參考文獻(xiàn)[5]相同，在此不贅述。

本研究采用的基因探針型號為：rs 9939609:C_30090620_10;rs1421085：C_8917103_10,2×ABI Taqman Universal PCR master mix,No AmpErase UNG (lot No. E09854),20 ng基因組DNA模板,儀器采用ABI7900HT Sequence Detection System。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)取70份樣品，約占總數(shù)的10%，基因分型結(jié)果與原先測定的結(jié)果完全符合。

rs9939609和rs1421085分型圖見圖1。

圖1 FTO基因SNP rs9939609和rs1421085多態(tài)性的檢測結(jié)果

Fig 1 FTO gene SNP rs9939609 and rs1421085 allele distribution plot

Notes A:rs9939609; B:rs1421085

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本情況 與正常對照組比較，肥胖+超重組的BMI、血清空腹葡萄糖(FPG)、空腹胰島素(FIns)和三酰甘油(TG)水平均顯著高于正常對照組(P<0.01)，具體數(shù)據(jù)見參考文獻(xiàn)[5]。

2.2 基因分布頻率的平衡性檢驗(yàn) rs9939609和rs1421085多態(tài)性的基因分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rs9939609：χ2=0.144,P=0.704；rs1421085:χ2=0.878,P=0.349)，基因型期望值與觀察值吻合較好，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 各組等位基因頻率及基因型頻率比較 肥胖、超重和正常對照組rs9939609分型成功率分別為94.9%(224/236例)、97.9(234/239例)和95.9%(231/241名)。rs9939609 AA基因型頻率：肥胖組為2.7%，超重組為0.4%，正常對照組為1.7%；肥胖+超重組A等位基因頻率顯著高于正常對照組，P=0.048,OR=1.437，95%CI: 1.006～2.078(表1)。

肥胖、超重和正常對照組rs1421085分型成功率分別為92.8%(219/236例)、97.1%(232/239例)和95.4%(230/241名)。rs1421085 CC基因型頻率：肥胖組為2.7%，超重組為0.9%，正常對照組為1.7%，肥胖+超重組C等位基因頻率高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.076，OR=1.388,95%CI:0.965～1.200(表2)。

2.4 FTO基因SNP rs9939609、rs1421085多態(tài)性與肥胖代謝指標(biāo)間的相關(guān)性 rs9939609 TT基因型BMI顯著低于TA+AA基因型(P=0.000 3)；rs1421085 TT基因型BMI顯著低于TC+CC基因型(P=0.000 5)。rs9939609 TT基因型FPG、FIns、TG、總膽固醇(TC)、HOMA-IR、QUICKI與TA+AA基因型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs1421085 TT基因型FPG、FIns、TG、TC、HOMA-IR、QUICKI與TC+CC基因型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表1 肥胖組、超重組和正常對照組rs9939609等位基因頻率及基因型頻率比較[n(%)]

Notes OB:obesity group;OW:overweight group;NC:normal control group;1)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=3.901,P=0.048,OR=1.437(95%CI:1.006-2.078);2)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=5.57,P=0.061 7

表2 肥胖組、超重組和正常對照組rs1421085等位基因頻率及基因型頻率比較[n(%)]

Notes OB:obesity group;OW:overweight group;NC:normal control group;1)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=3.148,P=0.076,OR=1.388(95%CI:0.965-1.200);2)obesity+overweight groupvsnormal control group,χ2=4.026,P=0.136 6

表3 FTO基因SNP rs9939609、rs1421085多態(tài)性與肥胖及其相關(guān)代謝指標(biāo)間的相關(guān)性

Notes M:male;F:female

3 討論

人類與肥胖相關(guān)的候選基因的數(shù)量有幾百種，其SNP數(shù)量也相當(dāng)龐大。1996年，Risch和Merikangas率先提出使用GWAS方法來確定基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性。近年來，隨著人類基因組計(jì)劃的順利完成和國際人類基因組單倍型圖計(jì)劃(HapMap Project)的不斷發(fā)展，以及高通量基因分型技術(shù)的成熟，使得同時研究幾萬，幾十萬，甚至幾百萬個SNP成為可能[6]，基因連鎖分析或候選基因策略，僅能在單基因缺陷的疾病或特性中發(fā)揮重要作用，但在特定疾病的多基因遺傳模式中，對確定多基因與復(fù)雜性疾病或特性的相關(guān)分析時作用相對有限。相對而言，GWAS能更精確地確定導(dǎo)致復(fù)雜性疾病的易感性基因,從而闡明這些復(fù)雜性疾病的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制,是目前科學(xué)界公認(rèn)的最為有效的復(fù)雜疾病的研究方法。2006年后，相繼有40多種復(fù)雜性疾病及其數(shù)量性狀(如BMI和身高等)的GWAS研究報(bào)道，并發(fā)現(xiàn)了某些以往未檢測到但與疾病或特性密切相關(guān)的基因和多態(tài)性位點(diǎn)，如FTO基因。

FTO基因位于染色體16q12.2，在藻類和脊椎動物中高度保守，但在無脊椎動物、真菌和綠色植物中不表達(dá)[7，8]。FTO基因?qū)儆诜茄t色加雙氧酶家族，編碼2-酮戊二酸-依賴型核酸脫甲基酶[9，10]。FTO基因mRNA在大腦內(nèi)，尤其下丘腦mRNA的表達(dá)最豐富，但在其他組織也有表達(dá)[7，9]。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠進(jìn)食時下丘腦弓狀核FTO基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)，禁食時則下調(diào)[9，11]，但在大鼠中調(diào)控模式與此相反[7]，F(xiàn)TO基因能夠使DNA去甲基化，并參與DNA修復(fù)、脂肪酸代謝和翻譯后修飾。

2007年，F(xiàn)rayling等[12]率先報(bào)道了位于FTO基因第1內(nèi)含子的rs9939609與成人和兒童肥胖具高度相關(guān)性，隨后在歐洲幾項(xiàng)獨(dú)立研究中，也分別報(bào)道了該基因多態(tài)性與高加索人群、西班牙人群BMI和肥胖的相關(guān)性。FTO基因是至今為止在歐洲人群中唯一的、重復(fù)成功的肥胖易感基因[13]。在東亞地區(qū)，在有限的報(bào)道中結(jié)果并不一致。目前在中國僅見臺灣、北京和上海地區(qū)的成年人群FTO基因多態(tài)性與肥胖的關(guān)聯(lián)報(bào)道。Chang等[14]報(bào)道，F(xiàn)TO基因rs9939609多態(tài)性與中國臺灣成人肥胖和BMI存在相關(guān)性，但與2型糖尿病無相關(guān)性；但在上海和北京的成人研究中未發(fā)現(xiàn)其與肥胖、BMI和糖尿病之間的關(guān)聯(lián)性[15]。在日本人群的研究結(jié)果也不盡相同，Horikoshi等[16]未發(fā)現(xiàn)rs9939609多態(tài)性與BMI和肥胖的相關(guān)性；Omori等[17]研究得出陽性結(jié)果。提示研究結(jié)果可能與人群樣本的選擇有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖+超重組rs9939609 A等位基因頻率顯著高于正常對照組，rs1421085 C等位基因頻率高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs1421085 TC +CC基因型和rs9939609 TA +AA 基因型的BMI顯著高于TT基因型。因此提示在中國漢族兒童青少年中rs1421085、rs9939609多態(tài)性均與肥胖的體脂形成有密切的關(guān)聯(lián)性。

本研究正常對照組rs9939609 A等位基因和rs1421085 C等位基因的頻率分別為9.7%和9.8%,其中A等位基因頻率略低于中國臺灣人群(12.6 %)[14]，而AA和CC的基因型頻率均為1.7%, 與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[14]，但明顯低于歐洲人群(45%)[18]和非洲裔美國人(21%)[13]，提示FTO基因該2個多態(tài)性位點(diǎn)基因頻率存在顯著的種族差異。

本研究人群的rs9939609和rs1421085多態(tài)性與BMI顯著相關(guān)，但與肥胖其他相關(guān)代謝指標(biāo)包括FPG、FIns、TC、TG和HOMA-IR等均無顯著相關(guān)性；與日本[15]和中國[16]的研究結(jié)果較為一致。1項(xiàng)納入17 037名高加索人群的Meta分析結(jié)果顯示，F(xiàn)TO基因SNP rs9939609和rs1421085多態(tài)性與FPG、TG、FIns存在相關(guān)性[19]。提示rs9939609和rs1421085多態(tài)性對肥胖患者代謝指標(biāo)的影響有種族和地區(qū)差異。

本研究首次證實(shí)了FTO基因多態(tài)性與中國漢族兒童青少年BMI的相關(guān)性，雖然其rs9939609 A等位基因頻率遠(yuǎn)低于歐洲人群，但該等位基因?qū)MI的作用與歐洲人群較為相似，但對代謝指標(biāo)影響卻有所不同。由于中國是個多民族國家，在其他民族兒童青少年中FTO基因該位點(diǎn)多態(tài)性是否還有類似的作用，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究的不足之處與局限性：本研究對象僅限于上海某地區(qū)的漢族兒童青少年。作為全基因組相關(guān)研究，研究對象的數(shù)量尚顯不足。

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