微陣列比較基因組雜交技術檢測不明原因智力低下/發(fā)育遲緩患兒的基因組拷貝數變異

陳曉麗 郭 金 王 珺 王立文 丁秀原 張 霆 吳柏林

兒童發(fā)育遲緩(developmental delay,DD)和智力低下(mental retardation,MR)發(fā)病率約為3%[1]。盡管傳統(tǒng)細胞遺傳學檢測(常規(guī)染色體G帶分析)、FISH和新近發(fā)展的多重連接依賴探針擴增法(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)等技術可提高MR/DD患兒的病因檢出率，但仍有50%的患兒病因不明[2]。近年來，隨著微陣列技術分辨率的提高，國外科研人員利用微陣列比較基因組雜交(array-comparative genomic hybridization, Array-CGH)技術對不明原因MR/DD患兒開展了全基因組拷貝數變異(copy number variations, CNVs)的研究，發(fā)現(xiàn)部分MR/DD患兒存在罕見CNVs，從而識別出一系列新的微缺失或重復綜合征[3,4]。中國至今尚未見這方面的研究報道。中國兒童MR/DD患病基數大，是神經科主要就診人群，其中至少有2/3病因不明[5]。本研究應用高分辨Array-CGH技術，對不明原因MR/DD患兒進行了初步的全基因組CNVs篩查，了解可能與MR/DD相關的罕見基因組CNVs在中國人群不明原因MR/DD患兒中的檢出率，以此評估Array-CGH對不明原因MR/DD可能的遺傳病因診斷作用。

1 方法

1.1 研究對象

1.1.1 MR的診斷標準 根據不同的年齡段，分別采用《兒心0～4歲精神發(fā)育量表》和《中國韋氏智力量表》測定兒童的發(fā)育商(DQ)或智商( IQ )，同時運用《嬰兒-初中生社會適應性能力量表》進行社會適應性能力評價。IQ或DQ<70，同時伴社會適應性能力低下者診斷為MR；>5歲稱為MR,<5歲稱為DD；以下統(tǒng)稱為MR/DD。

1.1.2 研究對象篩選標準 不明原因的MR/DD患兒指排除出生時產傷、生后中樞神經系統(tǒng)感染和(或)頭顱損傷、染色體G帶檢查異常和(或)其他已知遺傳性綜合征和遺傳病，同時符合以下至少1個條件：①伴發(fā)有其他體表和(或)內臟畸形，如先天性心臟病、脊柱畸形、多或少指(趾)等；②母親具有異常妊娠史，包括多次流產、胎死宮內、死產或出生缺陷；③患兒診斷為孤獨癥或具有孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)；④患兒具有典型面部特征或異常面容；⑤患兒存在嚴重的生長落后或發(fā)育遲緩。

1.1.3 研究對象剔除標準 所有患兒完成簡單尿液篩查以排除遺傳代謝性疾病，針對某些疑似綜合征患兒，如脆性X染色體綜合征(fragile X syndrome)或 Rett綜合征, 采用Southern Blotting或PCR、MLPA進行排除檢查。

1.1.4 倫理審核 所有患兒均為臨床病例，患兒監(jiān)護人填寫書面知情同意書或口頭同意參加全基因組CNVs檢測。本研究獲得首都兒科研究所倫理委員會批準。

1.2 Array-CGH檢測方法 按照美國波士頓兒童醫(yī)院臨床分子診斷實驗室的標準方法進行操作[6]。QIAGEN 抽提外周抗凝血的基因組DNA，獲得吸光度值和濃度后，取3～6 μg DNA于50 μL體系，37℃消化2 h(Alu Ⅰ和Rsa Ⅰ聯(lián)合消化)； QIAprep Spin Miniprep Kit進行DNA純化，重新測定吸光度值后，取2 500 ng DNA, 用BioPrime labeling kit進行熒光標記(cy5標記對照標本，cy3標記MR/DD標本)，37℃ 2 h后終止反應；再次MicroCon YM-30 純化熒光標記DNA后，將對照DNA和患兒DNA等量混合后加入雜交體系，94℃變性，37℃ 0.5 h，上樣到Oligo 244 K芯片上，65℃雜交爐孵育72 h后先用洗脫液1洗脫5 min，再用洗脫液2洗脫1 min， 迅速進行微陣列掃描，采用Feature Extraction 9.0進行數據提取至DNA analystic 5.0軟件進行CNVs分析。以上儀器和試劑均有商品化供應(Invitrogen和Agilent公司)。男女性對照DNA樣本購自Invitrogen公司。

針對所發(fā)現(xiàn)的罕見CNVs，盡可能采用雙親樣本重復Array-CGH檢測，了解其是否為新生(De novo)CNV。

1.3 MR/DD相關CNVs 的評估方法 針對所有發(fā)現(xiàn)的CNVs，首先將這些CNVs與國際基因組CNVs多態(tài)性數據庫(database of genomic variants,DGV)和UCSC brower(build 18)比對，了解其是否為罕見CNVs(rare CNVs)或常見CNVs(common CNVs)，然后根據美國波士頓兒童醫(yī)院遺傳診斷實驗室的CNVs 評估分析標準將CNVs分為6類(圖1)：①常見CNVs：至少有2例以上片段大小幾乎完全相同的CNVs或者80%以上區(qū)域完全重疊的相似CNVs，曾在DGV和UCSC brower中有報道；②罕見CNVs，且目前已明確與MR/DD相關(已發(fā)現(xiàn)的微缺失/重復綜合征)；③罕見CNVs,但很可能與MR/DD相關， 曾被DECIPHER數據庫、美國波士頓兒童醫(yī)院遺傳診斷實驗室的aCGH-CNVs 數據庫報道，或被既往的MR/DD微陣列基因組研究文獻所報道，且已報道的CNVs大小幾乎完全相同或者至少80%區(qū)域重疊；④新生CNVs：在正常父母樣本中未曾發(fā)現(xiàn)，該 CNVs雖然在研究文獻中未曾報道，但含有與MR/DD可能相關的重要基因；⑤臨床意義不明確的CNVs：該CNVs未曾報道，且父母未能參與研究；⑥家族性CNVs：已在正常父母樣本中證實。 以上分類②～④均屬于與MR/DD相關或很有可能相關的CNVs，對于此類CNVs，該區(qū)域內的基因名稱來自UCSC brower(build 18)。

圖1 CNVs 評估分析平臺

Fig 1 The workflow for CNVs evaluation

Notes MR:mental retardation;DD:developmental delay

1.4 文獻比對分析 在PubMed數據中，采用“unknown” or “unexplained”、“mental retardation” or “developmental delay”和“array”作為檢索詞，并組合成不同的檢索式進行檢索。時間為2006年1月1日至2009年7月31日，檢索到一系列利用微陣列技術對不明原因MR/DD人群進行全基因組CNVs研究的文獻，比對分析以確認本研究所發(fā)現(xiàn)的CNVs 在既往研究中是否有報道。涵蓋的研究方法不局限于Oligo CGH array，還包括BAC-CGH array和SNP array。

2 結果

2.1 研究對象的一般情況 2004年7月至2008年7月在首都兒科研究所共收集不明原因MR/DD患兒111例，均為漢族，平均年齡為6歲(1個月至16歲)，男女比例為1.775(71∶40), 86例(77.4%)伴有生長落后或發(fā)育遲緩；29例(26.1%)伴有其他畸形和(或)神經系統(tǒng)異常，包括先天性心臟病，多指或趾，骨骼或脊柱異常，驚厥，刻板或孤獨樣癥狀；13例(11.7%)患兒的母親具有異常妊娠史；32例(28.8%)患兒具有MR/DD家族史；45例(40.5%)患兒有典型面部特征。37/111例患兒完成了常規(guī)染色體G帶檢查，均提示正常染色體核型。

2.2 Array-CGH的結果及數據比對分析 28/111例患兒中發(fā)現(xiàn)36個CNVs(重復16個，缺失20個)，發(fā)生概率為32.4%(36個/111例)，CNVs平均長度為1 326 kb(29～8 760 kb)(表1)。

4/28例患兒獲得父母血樣進行親本鑒定，以了解患兒的CNVs是否為家族性遺傳。發(fā)現(xiàn)2例患兒具有新生CNVs；另2例為父親遺傳，其中1例遺傳自智力或神經、精神發(fā)育缺陷的父親，另1例父親的智力或神經、精神發(fā)育情況不詳。

對28例患兒所發(fā)現(xiàn)的36個罕見CNVs,利用美國波士頓兒童醫(yī)院遺傳診斷實驗室的CNVs評估分析平臺，結合DECIPHER數據庫和既往MR/DD相關的Oligo CGH array、BAC-CGH array和SNP array的研究報告，發(fā)現(xiàn)22個CNVs可能與MR/DD相關。由于部分患兒同時攜帶MR/DD相關CNVs和未報道CNVs，故最終評估確認19例患兒具有MR/DD相關CNVs，1例患兒的CNVs臨床意義不明確(表1)。因此，攜帶MR/DD致病相關CNVs的患兒檢出率為17.1%(19/111例)。

19個與MR/DD相關的罕見CNVs中，1例為16p11.2微缺失綜合征，Array-CGH結果見圖2；2例為Pelizaeus-Merzbacher病；2例涉及15q11-13的Prader-Willi綜合征/Angelman綜合征(PWS/AS)核心區(qū)域，Array-CGH結果見圖3；1例為Potocki-Lupski綜合征，Array-CGH結果見圖4；1例為Williams-Beuren綜合征；1例為16p13.11微缺失綜合征。

表1 不明原因MR/DD 患兒中CNVs類型特點

Notes 1) 16p11.2 Microdeletion syndrome; 2) Prader-Willi/Angelman syndromes (PWS/AS); 3) Williams-Beuren syndrome; 4) Atypical PWS; 5) Pelizaeus-Merzbacher disease;6) Potacki-Lupski syndrome; 7) 16p13.11 microdeletion syndrome; 8) father was NA, not maternal; NA: not available;-:not related

圖2 16p11.2微缺失綜合征患兒的Array-CGH 結果圖

Fig 2 Array-CGH data of a patient with 16p11.2 deletion

Notes A showed a 606 kb deletion in 16p11.2 region from patient 185. Each probe was represented as a single dot and plots on X axis according to its genome position. Duplication/deletion was shown respectively as red/green dot and normal as black one. The green/red bar was represented for the affected region. B showed the distribution of Refseq gene in UCSC Browser (build 18) and known common CNVs in DGV in enlarged affected region. The bottom red bar represents for known common CNVs and upper scattered blue bar was represented for Refseq gene

圖3 PWS患兒的Array-CGH 結果圖

Fig 3 Array-CGH data of a patient with 15q11.2-13 deletion associated with PWS

Notes A showed an approximately 5 Mb deletion at 15q11.2-13 from patient 232. Each probe was represented as a single dot and plots on X axis according to its genome position. Duplication/deletion was shown respectively as red/green dot and normal as black one. The green/red bar was represented for the affected region. B showed the distribution of Refseq gene in UCSC Browser (build 18) and known common CNVs in DGV in enlarged affected region. The bottom red bar was represented for known common CNVs and upper scattered blue bar was represented for Refseq gene

圖4 Potocki-Lupski綜合征患兒的Array-CGH 結果圖

Fig 4 Array-CGH data of a patient with Potocki-Lupski syndrome

Notes A showed an approximately 5 Mb duplication in 17p12-11.2 region from patient 221. Each probe was represented as a single dot and plots on X axis according to its genome position. Duplication/deletion was shown respectively as red/green dot and normal as black one. The green/red bar was represented for the affected region. B showed the distribution of Refseq gene in UCSC Browser (build 18) and known common CNVs in DGV in enlarged affected region. The bottom red bar was represented for known common CNVs and upper scattered blue bar was represented for Refseq gene

2.3 文獻比對分析 在PubMed數據庫通過文獻檢索，共獲得26篇涉及MR的Array-CGH 或其他微陣列芯片研究的文獻[2，7～31](包括MR人群研究和MR相關微陣列芯片研究回顧或綜述)。通過比對共發(fā)現(xiàn)461個CNVs， 涉及312個不同染色體條帶位點(圖5)，其中高發(fā)位點分別為22q11.2(19次)，Xp22.31(16次)，17p11.2(13次)，1p36.33(10次)，7q11.23(10次)，17q21.31(10次)，22q11.21(10次)，Xq28(10次)。本研究發(fā)現(xiàn)的CNVs中, 11/36個(30.6%)曾被既往MR微陣列研究文獻所報道。

圖5 MR相關CNVs在23條染色體上的分布

Fig 5 The distribution of CNVs related to MR on 23 chromosomes

Notes Rare CNVs from the literature review were mapped out according to position of 23 chromosomes (red/green). Red bar meant duplication and green meant deletion. Rare CNVs from our dataset are shown as black bars

2.4 1例非典型性PWS患兒的臨床表型 病例號211，男，2歲3個月，G3P2，足月順產，出生體重2 250 g，出生身長不詳，生后喂養(yǎng)較困難，體重增長緩慢，9個月會抬頭，1歲會坐，2歲會走，2歲會發(fā)“baba”和“mama”音，有驚厥史。父母否認近親結婚、孕期藥物毒物接觸和家族性MR病史。查體：體重10.5 kg(<第1百分位，P1)，身長80 cm(

圖6 非典型性PWS患兒面部表型和MRI所見

Fig 6 The facial characteristics and MRI in a patient with atypical PWS

Notes A,B:facial characteristics of patient 211 including flat face, sparse hair, hypertelorism and down-slanting eyes. Written consent to publish these images had been obtained from his legal guardian; C,D: MRI showed prominent bilateral frontal and temporal lobe sulcus, enlarged lateral ventricles

圖7 非典型性PWS患兒的Array-CGH結果和Refseq基因圖

Fig 7 The array-CGH data and scheme of Refseq gene in a patient with atypical PWS

Notes A: Array-CGH data showed the deletion in PWS/AS critical region of patient 211;B: Scheme of chromosome band and involved refseq genes in 15q11-13 (21219452-26208646). In the top panel, an ideogram showed deletion band of proximal chromosome 15q11.2-13. Bottom panel showed affected genes in this region. In middle panel, smaller black bar was represented for deleted region in patient 211, bigger black bar was represented for patient 232. The common candidate genes of PWS/AS includeSNRPN，NECDIN，SnRNAs，UBE3A

3 討論

3.1 Array-CGH在篩查MR/DD相關CNVs的診斷作用 Array-CGH屬于DNA微陣列技術一種，是在原有高分辨染色體CGH基礎上發(fā)展起來的分子遺傳學技術，其基本原理是用不同的熒光染料分別標記待測和參考DNA樣本，等量混合后與微陣列玻片上的oligonucleotide探針進行競爭性雜交。該技術通過一次雜交實驗就可以獲知整個基因組的CNVs，在染色體微結構改變、標記染色體來源的判定等方面具有明顯的診斷優(yōu)勢，可檢測出除基因突變或染色體平衡易位以外的幾乎所有基因組失衡。

目前，歐美發(fā)達國家已將DNA微陣列技術應用于不明原因MR/DD的常規(guī)分子遺傳檢測，并進入到患兒醫(yī)療保險內。國外眾多研究已證實在不明原因MR/DD患者中，10%～20%存在CNVs，并認為這種基因組失衡是MR/DD，甚至包括神經、精神疾患的致病原因之一[4，32，33]。另有遺傳學專家提出可將微陣列芯片取代常規(guī)染色體檢查，作為MR/DD患兒的首要檢查項目，以減少患兒就診費用和時間[31]。隨著微陣列技術的不斷發(fā)展，從BAC array，cDNA array到最新發(fā)展的寡核苷酸芯片(oligo array)，從44 K到100 K再到244 K和1 M，微陣列芯片分辨率快速提高，即使50～100 K的微缺失或重復都能成功捕獲，這使得MR/DD患兒基因組失衡的陽性檢出率極大提高。而早期BAC 芯片，通常100 kb片段僅覆蓋1個克隆，陽性檢出率<10%[3]。本研究使用Agilent公司的Oligo 224 K芯片，陽性檢出率為17.1%(19/111例),與國外研究報道大致相符[34]，這些結果極大豐富了MR/DD的臨床病因學研究，也說明該芯片可用于不明原因MR/DD的病因診斷。

除Array-CGH外，定量PCR、MLPA技術以及SNP array 也可對基因組進行拷貝數分析，定量PCR和MLPA技術由于涉及基因組特定位點，CNVs檢出能力無法與微陣列芯片相比。國外研究顯示，MLPA能發(fā)現(xiàn)5%～10%不明原因MR患兒存在亞端粒區(qū)域CNVs[35]。中國北京大學第一醫(yī)院兒科曾利用MLPA分析39例MR患兒的23條染色體亞端粒結構，發(fā)現(xiàn)4例(10%)存在亞端粒拷貝數缺失或重復[5]。SNP array是另一種新發(fā)展的DNA微陣列，Affymetrix公司的SNP 6.0雜交芯片將SNP位點探針和已知CNVs探針結合，提高了分辨率和基因組CNVs的檢出能力。Bernardini等[36]利用SNP 6.0芯片平臺，重新對51個既往低分辨率芯片結果陰性的患者進行研究，顯示6%患者存在3個可能致病的CNVs,且CNVs片段均>75 kb。此類芯片不僅可發(fā)現(xiàn)已知可能致病的CNVs，還可以分析雜合子丟失(loss of heterozygosity，LOH)和SNP位點信息。

3.2 MR/DD相關罕見CNVs的評估方法 隨著比較基因組學研究的快速發(fā)展，如何發(fā)現(xiàn)和評估罕見致病性CNVs已成為一個面臨挑戰(zhàn)的重要任務。目前，國外很多分子診斷實驗室都針對各自的實驗平臺，制定相應的評估方法[30，31，34，37]，主要因素包括：①是否為新生CNVs；②是否在正常人群中有報道；③CNVs長度是否足夠大；④是否在DECIPHER 或自己實驗室的數據庫中有報道，且攜帶者具有MR/DD表型[4]。但由于患兒雙親取樣困難，因此臨床信息、DGV和DECIPHER數據庫比對顯得尤為重要。本研究中將“是否曾在不明原因MR/DD人群中有報道”加入評估標準中，因為一些既往研究并沒有將自己發(fā)現(xiàn)的罕見CNVs數據載入DECIPHER數據庫。本研究結果顯示，6個CNVs未被DECIPHER數據庫報道。因此通過結合既往研究和美國波士頓兒童醫(yī)院Array-CGH數據庫，本研究最終將其中3個歸為可能的致病性CNVs(表1)，提高了MR/DD相關CNVs的診斷檢出率，也提示既往文獻回顧可作為MR/DD相關CNVs的一種評估方法。

3.3 非典型性PWS PWS/AS 是由于15q11-13區(qū)域上部分或全部印記基因簇發(fā)生突變、缺失、甲基化修飾異?；蛘邌斡H二體所引起。如果母本基因在該區(qū)域甲基化導致基因表達沉默而父本基因出現(xiàn)突變、缺失、甲基化異?；騿斡H二體則導致PWS，如果父本基因在該區(qū)域甲基化導致基因表達沉默而母本基因出現(xiàn)突變、缺失、甲基化異?；騿斡H二體則導致AS。15q11-13區(qū)域父本基因缺失是PWS最常見的病因[38]；而母本基因異常則導致AS。本研究發(fā)現(xiàn)2例患兒(病例號232和211)存在PWS/AS關鍵區(qū)域缺失，其中1例(病例號232)缺失4 989 kb，涉及SNRPN、NECDIN、SnRNAs和UBE3A等重要印記基因簇，1例(病例號211)雖然缺失區(qū)域僅為2 098 kb，仍包含以上重要致病基因，從基因組特點可稱為非典型性PWS。

4 總結

本研究利用國際前沿的Array-CGH對中國人群中不明原因MR/DD患兒開展與MR/DD相關的CNVs研究，結果顯示17.1%患兒攜帶可能與MR/DD相關的致病CNVs，其中已確定的部分罕見CNVs是中國人群中部分不明原因MR/DD患兒的發(fā)病原因之一。本研究同時發(fā)現(xiàn)，Array-CGH可幫助診斷某些與MR/DD相關但臨床不易察覺的非典型性綜合征，為部分不明原因的MR/DD患兒提供準確的遺傳病因診斷。本研究作為轉化醫(yī)學研究的一項實踐，不僅可將這個新的技術平臺在中國及時推廣應用于臨床實踐，加強和提高對不明原因MR/DD的分子診斷水平，而且對這些已發(fā)現(xiàn)的罕見CNVs區(qū)域所包括的許多基因可做進一步的挖掘，從中發(fā)現(xiàn)關鍵的致病主基因，并深入研究其致病機制，實現(xiàn)轉化醫(yī)學B2B(from bench to bed)的目標。

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