丹龍腰痛顆粒提取純化工藝研究

龍玉堂，夏新華*，雷 楊，陳 希

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

丹龍腰痛顆粒提取純化工藝研究

龍玉堂，夏新華*，雷 楊，陳 希

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 研究丹龍腰痛顆粒的最佳提取純化工藝條件。方法 以浸膏得率和丹酚酸B浸出量為指標(biāo)，對(duì)丹龍腰痛顆粒提取純化的工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果 確定丹參等水提的最佳工藝為：丹參等飲片浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分別為10、8倍量，提取時(shí)間分別為1.5、1.0 h，提取液濃縮至相對(duì)密度1.20，加乙醇使藥液含醇量達(dá)60%。結(jié)論 該工藝經(jīng)中試實(shí)驗(yàn)，表明穩(wěn)定可行。

丹龍腰痛顆粒；提取純化工藝；正交試驗(yàn)；丹酚酸B；高效液相色譜法

丹龍腰痛顆粒由丹參、地龍、牛膝、杜仲、狗脊等10味藥組成，具有活血通絡(luò)，宣痹止痛，補(bǔ)腎強(qiáng)腰的功能。丹參為該制劑的君藥，所含有效成分包括脂溶性藥有效成分（如丹參酮ⅡA）與水溶性有效成分（如丹酚酸B、丹參素）二類。但隨著丹參研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)丹參中的水溶性成分在藥理作用上比脂溶性成分要強(qiáng)，丹酚酸B和丹參素是其中的主要水溶性藥效成分，而丹參素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于丹酚酸B。丹酚酸B具有改善腎功能、防治心血管疾病、清除羥自由基、抗缺血損傷、抗凝血、抗血栓、抗炎、肝損傷保護(hù)及促進(jìn)纖維蛋白溶解等作用[1-3]。因此，本文以丹酚酸B轉(zhuǎn)移率為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)該制劑的提取純化工藝進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

島津LC-10AT高效液相色譜儀、SPD-10A紫外檢測(cè)器（日本島津儀器有限公司）；AY120 Shimadzu電子分析天平（日本島津儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SK3300H 超聲儀（HENGAO T＆D）。

1.2 試藥

丹酚酸B對(duì)照品 批號(hào)：111562-200807，供含量測(cè)定用，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；丹參等飲片購(gòu)自長(zhǎng)沙市佰佳中藥飲片公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定與生藥學(xué)教研室劉塔斯教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖；甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Apollo C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇∶乙腈∶甲酸∶水（30∶10∶1∶59）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm；柱溫為30℃；流速:1.0 mL/min。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品11.0 mg，置入10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取0.73 mL置入10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（0.080 3 mg/mL）。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取濃度為0.080 3 mg/mL的丹酚酸 B 對(duì)照品溶液 2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：

表明丹酚酸B在0.160 6～0.803 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 供試品溶液的制備與測(cè)定 精密量取水提液5 mL于25 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻,過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液適量，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2 水提次數(shù)的考察

稱取丹參、地龍、牛膝等飲片適量，回流提取3次，加水量分別為8、6、6倍量，提取時(shí)間均為1.5 h，分別收集各次提取液，定容至1 000 mL，依法測(cè)定浸膏得率和丹酚酸B轉(zhuǎn)移率。由表1可以算出，第3次提取丹酚酸B的轉(zhuǎn)移率僅占3次總量的8.5%，故提取2次即可。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取次數(shù)對(duì)浸出的影響（%）

2.3 丹參等提取工藝的優(yōu)選

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]在提取次數(shù)考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法對(duì)丹參、地龍、牛膝等提取的其它工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。選擇浸泡時(shí)間（A）、加水量（B）、提取時(shí)間（C）作為考察因素，以浸膏得率及丹酚酸B提取轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9（34）正交表安排試驗(yàn)。所選因素水平及正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表2～3。

表2 醇提工藝正交試驗(yàn)因素水平表

2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 依處方比例稱取丹參等飲片適量,共9份，照表2的安排，分別回流提取2次，收集提取液，濾過(guò)，定容至1 000 mL。依法測(cè)定浸膏得率與丹酚酸B含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析 對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以浸膏得率為指標(biāo)，方差分析表明A、B、C 3因素對(duì)浸膏得率均無(wú)顯著性影響（見(jiàn)表4）。以丹酚酸B轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，方差分析（見(jiàn)表5）顯示B因素（加水量）對(duì)浸出有顯著性影響，根據(jù)直觀分析,B因素取B3為佳；A、C 2因素對(duì)浸出的影響不明顯，可任取一水平，從降低生產(chǎn)成本、減少能耗等角度綜合考慮，分別選取A3與C2。綜上可確定提取工藝的最優(yōu)條件為A3B3C2，即提取時(shí)浸泡1.5 h，提取2次，加水量分別為飲片的10、8倍量，提取時(shí)間分別為1.5、1.0 h。這一方案與正交表中丹酚酸B轉(zhuǎn)移率最高的第9號(hào)試驗(yàn)方案一致，表明所選提取工藝條件合理可行。

表4 水提浸膏得率方差分析表

表5 丹酚酸B轉(zhuǎn)移率方差分析表

2.4 純化工藝的研究

2.4.1 藥液濃縮程度的考察 稱取丹參、地龍、牛膝等飲片適量,按上述優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，收集提取液，濃縮至適量。取等體積濃縮液3份，分別進(jìn)一步濃縮至相對(duì)密度為1.20、1.17、1.11（60℃熱測(cè)），加乙醇至含量達(dá)60%，靜置24 h，濾過(guò)，殘?jiān)?0%乙醇沖洗，分別定容至1 000 mL，依法測(cè)定浸膏得率與丹酚酸B轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明，藥液濃縮至相對(duì)密度為1.11～1.20（60℃），醇沉后丹酚酸B轉(zhuǎn)移率與浸膏得率差別不大，但從減少乙醇消耗量來(lái)考慮，則以相對(duì)密度1.20為佳（見(jiàn)表6）。

表6 藥液濃縮程度對(duì)醇沉的影響（%）

2.4.2 藥液含醇量的考察 取丹參、地龍、牛膝等飲片的提取液，濃縮至相對(duì)密度為1.20（60℃熱測(cè)）。取等體積濃縮液3份，分別加乙醇至含量達(dá)50%，60%，70%。靜置24 h，過(guò)濾，殘?jiān)謩e用同濃度的乙醇沖洗，分別定容至1 000 mL，依法測(cè)定浸膏得率與丹酚酸B轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明，醇沉藥液含醇量達(dá)60%時(shí)，丹酚酸B具有較高的轉(zhuǎn)移率（見(jiàn)表7）。

表7 藥液含醇量對(duì)醇沉的影響（%）

3 結(jié)論

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)研究，可確定丹龍腰痛顆粒提取純化的最佳工藝條件為：取丹參等飲片，加水浸泡1.5 h，提取2次，加水量分別為10、8倍量，提取時(shí)間分別為1.5、1.0 h；醇沉?xí)r，藥液濃縮至相對(duì)密度為1.20（60℃熱測(cè)），加乙醇至藥液含醇量達(dá)60%。該工藝經(jīng)中試生產(chǎn)，表明穩(wěn)定可行，故適合工業(yè)化生產(chǎn)。

該制劑中丹參所含水溶性有效成分丹酚酸B的熱穩(wěn)定性較差，故對(duì)提取液采取減壓低溫濃縮。另外，醇沉?xí)r控制藥液的相對(duì)密度為1.20（60℃），而未進(jìn)一步提高藥液的濃縮程度，亦是為了減少藥液的受熱時(shí)間，以盡量避免丹酚酸B等有效成分的破壞；同時(shí)，濃縮程度過(guò)大，藥液黏稠度過(guò)高，醇沉?xí)r有效成分分散較慢，易被快速析出的雜質(zhì)包裹而損失。

[1]杜冠華,張均田.丹參水溶性有效成分-丹酚酸研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2000,20(5):394-398.

[2]薛春生,王浴生,鄧文龍.中藥藥理與應(yīng)用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:190.

[3]湛月娥,孫莉莎,程玉芳,等.丹酚酸B對(duì)犬心肌耗氧量的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(9):1 001.

[4]葉 勇，譚漢梯，江 帥.正交試驗(yàn)法優(yōu)選丹參中丹酚酸B的提取工藝[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（6）：22-23.

Optimum extraction and purification conditions of Danlong Yaotong granules

LONG Yu-tang，XIA Xin-hua，LEI Yang，CHEN Xi(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study the optimum conditions of extraction and purification of Danlong Yaotong granules.MethodsThe extraction and purification conditions were optimized with the extract yield and the amount of the extracted Salvianolic acid B as indexes.Result The optimal extract condition of Salviae Miltiorrhizae was as follows:soaking 1.5 hours in water,extracting two times,and the water was 10 and 8 times respectively,the extraction time were 1.5and 1.0 hours respectively,the relative density of the liquid was 1.20 and 60%if the alcohol was added in it.ConclusionThe extraction process is stable,feasible and suitable for industrial production.

Danlong Yaotong granules；extraction and purification process；orthogonal test；salvianolic acid B;HPLC

R283.6

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.012.037.03

2010－04－20

龍玉堂（1983-），男，湖南衡陽(yáng)人，碩士研究生,主要從事中藥新制劑工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。

* 夏新華，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：xiaxinhua001@163.com。

（本文編輯 徐愛(ài)良）