龍血竭外用對糖尿病大鼠皮膚潰瘍Smads蛋白表達的影響

賀選玲 ，肖 凡 ，王莘智 ，黃政德 *

（1.長沙市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 長沙 410002；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

龍血竭外用對糖尿病大鼠皮膚潰瘍Smads蛋白表達的影響

賀選玲1，肖 凡2，王莘智3，黃政德1*

（1.長沙市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 長沙 410002；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 探討龍血竭外用對糖尿病大鼠皮膚潰瘍Smads（drosophila mothers against decapentaplegic protein）蛋白表達的影響。方法 建立糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型，以胰島素為對照藥，隨機分為龍血竭組、胰島素組、模型組、正常組。龍血竭組予以龍血竭膠囊內(nèi)容物外用于創(chuàng)面，每天換藥1次，連續(xù)用藥14 d；胰島素組予以胰島素稀釋液外用于創(chuàng)面，每天換藥1次，連續(xù)用藥14 d；模型組、正常組大鼠將創(chuàng)傷面暴露于外，不作任何處理。檢測各組大鼠Smads蛋白表達水平。結(jié)果 模型組Smad3、Smad4的表達水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；各用藥組Smad3、Smad4的表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。龍血竭組Smad3、Smad4表達水平低于胰島素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 龍血竭對糖尿病大鼠皮膚潰瘍Smads蛋白表達有下調(diào)作用。

龍血竭；糖尿?。黄つw潰瘍；Smads蛋白；大鼠

糖尿病是一種全身慢性代謝性疾病，它可引起全身小動脈、微小血管硬化，造成局部血供不良引起組織缺氧缺血壞死，形成潰瘍。糖尿病潰瘍是糖尿病常見和嚴重的并發(fā)癥，臨床主要表現(xiàn)為局部潰瘍、感染和壞疽，常給患者帶來巨大的痛苦和沉重的經(jīng)濟負擔。近年來，其發(fā)病率逐年上升，臨床治療難度大，影響因素多，效果欠佳，預(yù)后差。龍血竭是中醫(yī)治療潰瘍的主藥，《本草綱目》記載可用于金瘡出血，破積血，止痛生肉，去五臟邪氣。補虛益陽精，清一切惡瘡疥癬。

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在用龍血竭治療糖尿病潰瘍的前期臨床研究[1]中，發(fā)現(xiàn)龍血竭外用是治療糖尿病皮膚潰瘍的一種有效藥物，治療組有效率為83.3%,優(yōu)于對照組51.5%,且治療組顯效率達55.5%,明顯優(yōu)于對照組的24.2%。為探討血竭治療糖尿病皮膚潰瘍的作用機制，根據(jù)資料顯示龍血竭的可能作用機制，我們從與組織修復(fù)作用密切相關(guān)的Smads蛋白入手進行了龍血竭對糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面的實驗研究?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 龍血竭膠囊（云南云河藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字 Z53020999，批號：090835，0.3g/粒）。

1.1.2 動物 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）：2009-0004。

1.1.3 試劑 免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法 (streptavidin-biotin peroxidase method，SP)試劑盒、Smad3一抗、Smad4一抗、HRP標記山羊抗兔二抗（美國Invitrogen公司）、DAB顯色液（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）、化學(xué)發(fā)光底物（美國Pierce公司）。

1.1.4 儀器 Sigma 3K18型低溫冷凍離心機（美國Sigma公司）；電子分析天平Toledo（瑞士METTLER公司）；IMS細胞圖像分析系統(tǒng)（上海申藤信息技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模[2-3]選取48只SD大鼠給予鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)30 mg/kg腹腔內(nèi)1次快速注射，STZ臨用前以無菌枸掾酸鈉液配制成2%濃度的溶液，pH 4.5。糖尿病動物模型在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后72 h均經(jīng)尾靜脈采血，用傳統(tǒng)的氧化酶反應(yīng)檢測血糖水平。誘導(dǎo)后72 h血糖水平＞16.7 mmol/L時，即可視為糖尿病模型誘導(dǎo)成功。選取糖尿病造模成功的大鼠36只制作糖尿病皮膚潰瘍模型，參照付小兵等[2]全層皮膚缺損法制成動物體表潰瘍模型，將糖尿病大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉后背部備皮，在脊椎兩側(cè)作直徑15 mm的圓形標記，用外科方法切除標記處全層皮膚，止血后用無菌紗布覆蓋，即成糖尿病潰瘍模型。

1.2.2 動物分組及給藥方法 將36只糖尿病皮膚潰瘍模型大鼠隨機分為龍血竭組、胰島素組、模型組（糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面不用藥），共3組，每組12只。正常創(chuàng)面組（正常大鼠創(chuàng)面不用藥）12只（空白組）。龍血竭組予以龍血竭膠囊內(nèi)容物外撒于創(chuàng)面，每天換藥1次，連續(xù)用藥14 d；胰島素組予以胰島素稀釋液 (比例：生理鹽水10 mL、胰島素4 U）外用于創(chuàng)面，換藥1次/d，連續(xù)用藥14 d；模型組、正常組大鼠將創(chuàng)傷面暴露于外，不作任何處理。用藥后第15天，分別將動物麻醉(水合氯醛)后處死，取局部創(chuàng)面組織為所需實驗樣品。

1.2.3 Smad3、Smad4mRNA蛋白表達的檢測 取各組大鼠創(chuàng)面組織，生理鹽水清洗后，4%多聚甲醛固定溶液固定。每組隨機選取12個樣本，將已固定的各肉芽組織標本分別常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，連續(xù)切片；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；阻斷 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min；抗原修復(fù)：置 0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸（95 ℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min。10%正常血清封閉內(nèi)源性非特異性，室溫30 min正常羊血清工作液封閉，37℃ 10 min，傾去勿洗.滴加一抗4℃ 冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗,37℃孵育30 min,PBS沖洗3×5 min;滴加HRP標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育 30 min，PBS 沖洗 3×5 min；DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。圖像分析，IMS細胞圖像分析系統(tǒng)，通過顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機采集數(shù)字圖像，數(shù)字圖像為標準的BMP(位圖)文件格式；在100倍顯微鏡下，先點擊圖像微尺上的兩個點，再將它的實際微米數(shù)輸入計算機，計算機自動計算得到比例因子后存儲備用；消除免疫組化圖像中的紫藍色背景；選擇陰性區(qū)域，處理后用藍色表示；選擇棕黃色或棕褐色陽性區(qū)域，處理后用紅色表示；測定圖像中陽性區(qū)域面積和陽性比率以及光密度值，以積分光密度值代表Samd3、Smad4的表達水平。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

模型組Smad3、Smad4的表達水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；各用藥組 Smad3、Smad4的表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。龍血竭組smad3、smad4表達水平低于胰島素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織Smad3、Smad4mRNA 表達（±s）

表1 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織Smad3、Smad4mRNA 表達（±s）

注：與龍血竭組比較△P＜0.05；與胰島素組比較▲P＜0.05；與模型組比較☆P＜0.05；與正常組比較★P＜0.05。

組 別龍血竭組胰島素組模型組正常組n 12 11 10 12 Smad3 20 693.33±736.33▲☆25 651.38±1 213.07△☆★35 141.11±2 514.40△★19 132.89±730.57☆Smad4 48 748.79±952.54▲☆52 166.75±1 357.19△☆★60 608.33±1 013.71△★47 045.95±918.14☆

3 討論

臨床與實驗研究發(fā)現(xiàn) ，糖尿病潰瘍多有“瘡口下陷，久不收口，腐肉已脫，起白色厚邊。膿液稀少，肉芽灰白或黯淡，瘡周皮膚色暗黑，板滯木硬?；蚯嘟铒@露。舌暗紅或淡紫，或有瘀斑。苔白膩，脈細澀”等“虛”、“瘀”之象?！熬貌”靥摗?、“久病必瘀”、“虛可致瘀，瘀可致虛”，糖尿病潰瘍創(chuàng)面久不愈合的主因在于氣虛血瘀的存在，我們認為只有氣血足、局部瘀滯祛除，才能斷生腐之源，生肌長皮。故臨床治療常以“祛瘀生新”為指導(dǎo)，提出“祛瘀生肌”、“補虛生肌”理論。

血竭具有活血散瘀、止痛、止血、生肌斂瘡的功效。龍血竭的生肌收斂作用在預(yù)防皮膚軟組織損傷中作用顯著，應(yīng)用龍血竭后，患處腫脹消退迅速，未完全受損的組織快速恢復(fù)正常，受損局部血液循環(huán)迅速建立，促使創(chuàng)面組織軟化，重建活力，促進愈合?！侗静菥V目》云：麒麟竭……此物干如血，故謂之血竭主治心腹卒痛，金瘡出血，破積血，止痛生肉，去五臟邪氣。補虛益陽精，清一切惡瘡疥癬，散淤血渚痛……”并推崇血竭為“和血圣藥”。有大量文獻報道血竭可治療糖尿病并發(fā)的潰瘍。我院在前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，龍血竭外用是治療糖尿病足潰瘍的一種有效藥物，故對龍血竭進行進一步研究。

糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面修復(fù)愈合是一個連續(xù)的復(fù)雜過程，其中多種細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)之間錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用是該過程中的關(guān)鍵因素之一[4]。Smads蛋白與TGF-β1在組織修復(fù)中的作用密切相關(guān)[5]，目前已被公認為“修復(fù)相關(guān)基因”，其中Smad3、Smad4與TGF-β的信號調(diào)控最為密切。Smad3可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合，且必須與Smad4形成復(fù)合物，才能遷移至細胞核中促進靶基因表達。Smad3、Smad4基因的失控可能是創(chuàng)面愈合延遲、不愈合或瘢痕過度增生的真正原因[6]。提示糖尿病創(chuàng)面組創(chuàng)面Smad3、Smad4的高表達可能是糖尿病創(chuàng)面愈合緩慢的原因之一。故本研究從龍血竭對糖尿病大鼠皮膚瘍Smads蛋白表達的影響來探討龍血竭治療糖尿病皮膚潰瘍的作用機制。本項研究結(jié)果顯示龍血竭組smad3、smad4表達水平低于陽性對照組(P＜0.05)，與正常組無明顯差異(P＞0.05)。由此我們推測下調(diào)smad3、smad4表達水平可能是龍血竭治療糖尿病皮膚潰瘍的作用機制。

[1]黃政德，王莘智，賀選玲，等.龍血竭膠囊治療糖尿病足潰瘍療效觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（7）：72.

[2]付小兵，王德文.創(chuàng)傷修復(fù)基礎(chǔ)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：202-216.

[3]孫同柱，付小兵，趙志力，等.重組人血小板源性生長因子凝膠劑促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的實驗研究[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2003，15（10）：596-599.

[4]Akman H O，ZhangH，SiddiquiM A，etal.Response to hypoxia involves transforming growth factor-β2 and SMAD proteins in human endothelial[J].Blood，2001，98(12)：3324-3331.

[5]AshcrcftG S，Roberts A B.Loss ofSmad3 modulates wound healing[J].Cytokine Growth Factor Rev，2000，11(1)：125-131.

[6]邱艷飛，朱旭東，劉 琛，等.大鼠皮膚傷口愈合中轉(zhuǎn)化生長因子β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad3、Smad4的表達[J].中華創(chuàng)傷雜志，2002，18(7)：407-409.

Effects of dracaena on expression of Smads protein in skin ulcers in diabetic rats

HE Xuan-ling,WANG Shen-zhi,HUANG Zheng-de
(TCM Hospital of Changsha,Changsha,Hunan 410002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Dracaena on expression of Smads protein in skin ulcers in diabetic rats.MethodsThe models of the skin ulcers model in diabetic rats were induced and Insulin was used as the control drug,all the rats were randomly divided into the Dracaena group,Insulin group,modelgroup and normalgroup.In Dracaena group,the contents of Dracaena capsule was used outside the wound dressing,in Insulin group,the Insulin diluent used to the wound dressing,one time a day,continuous medication 14 days in both groups;in the normal and model groups,the wounded surface was exposed to the air and without any treatment.Then,the protein levels of Smads were detected.ResultsThe expression levels of Smad3 and Smad4 in model group were higher than those in the normal group(P＜0.05);the expression levels of Smad3 and Smad4 in treatment group lower than those in model group(P＜0.05).the expression levels of Smad3 and Smad4 in Dracaena group lower than those in In-sulin group(P＜0.05),but compared with normal group,the difference was not statistically significant(P＞0.05).Conclusions Dracaena is effective to reduce Smads protein expression in skin ulcers in diabetic rats.

Dracaena；diabetic；skin ulcers；Smads protein；rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.007.023.03

2010-03-12

湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計劃資助項目（2009SK3122）。

賀選玲（1980-），女，湖南雙峰人，博士，主要從事中醫(yī)內(nèi)科病研究工作。

* 黃政德，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：HZD112＠163.com。

（本文編輯 彭芝配）