結(jié)直腸癌組織中抑癌基因PTEN的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

徐臣光 (浙江省泰順縣人民醫(yī)院 325500)

PTEN(第10號(hào)染色體丟失的與張力蛋白同源的磷酸酶基因)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，在維持細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用，因其獨(dú)特的作用途徑和在多種人類(lèi)腫瘤的發(fā)病機(jī)制中的重要作用而備受重視[1]。研究表明，PTEN是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)腫瘤中最易發(fā)生突變的抑癌基因[2]。人類(lèi)許多腫瘤中存在著PTEN功能的失活。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)PTEN蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)，并探討其與患者的臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 60例標(biāo)本均選自我院病理科存檔蠟塊，為2005年1月至2008年2月間收集的原發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，切片厚4μm。男37例，女23例；年齡37～75歲，平均54.2歲。所有標(biāo)本的患者術(shù)前均未接受化療及放療，另外取36例癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5cm以上)作對(duì)照。

1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人PTEN單克隆抗體(一抗，即用型)和免疫組化Envision試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；YWY 781醫(yī)用微波儀，浙江臨安電子器材廠；LEICA顯微鏡DMLB，德國(guó)徠卡公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，嘉興新塍東城儀器廠；組織陳列儀為朝陽(yáng)恒泰科技發(fā)展公司的產(chǎn)品(HT-1型)。

1.3 免疫組化染色 采用Envision二步法。切片常規(guī)脫蠟，3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育20min，水洗，0.05%胰酶37℃消化15min，PBS液沖洗，正常血清阻斷10min，分別滴加一抗工作液，PBS液沖洗，滴加二抗工作液37℃孵育30min，PBS液沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明和封片。以正常扁桃體組織做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞未著色及陽(yáng)性細(xì)胞<5%為陰性(－)；5%～25%的細(xì)胞顯色為弱陽(yáng)性(＋)；25%～50%的細(xì)胞顯色為中等陽(yáng)性(＋＋)；>50%的細(xì)胞顯色為強(qiáng)陽(yáng)性(＋＋＋)。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá) PTEN主要在結(jié)直腸癌胞漿表達(dá)，部分病例也可見(jiàn)到胞漿和胞膜同時(shí)著色，且染色較強(qiáng)。60例結(jié)直腸癌標(biāo)本中PTEN的陽(yáng)性表達(dá)為18例(30.0%)，其中強(qiáng)陽(yáng)性為6例(10.0%)，部分標(biāo)本表達(dá)降低或缺失。36例癌旁正常組織中PTEN蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性，其中強(qiáng)陽(yáng)性31例(86.1%)。

2.2 結(jié)直腸癌中PTEN的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)直腸癌高、中、低分化PTEN表達(dá)陽(yáng)性情況依次為12例(50.0%,12/24)、5例(25.0%，5/20)和1例(1/16)，低分化、中分化結(jié)直腸癌陽(yáng)性率較高分化明顯降低(χ2=9.107,P<0.01)，且PTEN表達(dá)水平隨原發(fā)病灶的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈逐漸下降趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中PTEN的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、有序的過(guò)程，主要是由于癌基因功能增強(qiáng)、抑癌基因及DNA修復(fù)基因突變或功能缺失所致。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致的細(xì)胞異常增殖是該過(guò)程中的重要分子機(jī)制之一[3]。

PTEN是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的抑癌基因。PTEN基因定位于染色體10q23.3，全長(zhǎng)218 kb，有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)1212 bp，mRNA長(zhǎng)5.5 kb，其cDNA含有一個(gè)1209 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼由403個(gè)氨基酸殘基組成。PTEN中與抑癌功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域主要是氨基端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域。PTEN蛋白的氨基端與張力蛋白和輔助蛋白高度同源，與肌動(dòng)蛋白在錨著點(diǎn)處結(jié)合，與該位點(diǎn)的復(fù)合物共同參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，故PTEN可能通過(guò)下調(diào)該位點(diǎn)復(fù)合物中的整合素來(lái)抑制腫瘤。此外，PTEN還可通過(guò)參與細(xì)胞的聚集黏附而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。目前已經(jīng)證實(shí)PTEN與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。在許多腫瘤中都有FIEN基因表達(dá)異常，且其表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為有一定相關(guān)性。

柯細(xì)松等[4]應(yīng)用PCR-LIS-SSCP 法對(duì)大腸癌及正常大腸石蠟包埋組織中PTEN的第7、8個(gè)外顯子進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)，結(jié)果10例正常大腸組織未見(jiàn)陽(yáng)性帶，60例大腸癌標(biāo)本中，第7外顯子SCPP帶型陽(yáng)性檢出率為46.7%，第8外顯子未見(jiàn)陽(yáng)性帶。唐衛(wèi)中等[5]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)23例大腸正常黏膜組織、28例大腸腺瘤和75例大腸癌中PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)正常大腸黏膜與大腸腺瘤之間無(wú)明顯差異，而75例大腸癌中有24例蛋白丟失，43例蛋白表達(dá)低下，只有8例蛋白表達(dá)正常，總陽(yáng)性率達(dá)68%(51/75)，與正常大腸黏膜及大腸腺瘤差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Taniyama等[6]用RT-PCR和免疫組化方法在mRNA水平上檢測(cè)正常結(jié)腸黏膜組織、結(jié)腸腺瘤組織和癌組織檢測(cè)PTEN的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸組織中均無(wú)PTEN丟失。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中PTEN蛋白的表達(dá)降低或缺失，且PTEN表達(dá)水平隨原發(fā)病灶的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈逐漸下降趨勢(shì)，這與Jiang等[7]的研究結(jié)果是一致的。表明隨著腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，PTEN 蛋白表達(dá)下降。PTEN 能下調(diào)PIP3/ AKt途徑，誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF21)合成而致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)合成增加。體內(nèi)外試驗(yàn)表明，野生型PTEN過(guò)表達(dá)通過(guò)PIP3激酶信號(hào)傳導(dǎo)，增加VEGF介導(dǎo)的各種細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞分裂、遷移等[8]。同時(shí)，PTEN表達(dá)缺失或降低能使金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)易于表達(dá)。Maehama等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 能使FAK去磷酸化，從而干擾細(xì)胞間的黏附性。而腫瘤細(xì)胞中PTEN丟失或表達(dá)下降，使MMPs及VEGF合成增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向基質(zhì)浸潤(rùn)和血管形成，形成腫瘤組織細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，本研究結(jié)果支持以上觀點(diǎn)。

大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)有多種基因參與、相互作用的復(fù)雜過(guò)程。PTEN參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，PTEN基因與結(jié)直腸癌臨床病理特征具有明顯相關(guān)性。PTEN基因有望成為結(jié)直腸癌基因治療的新靶點(diǎn)。

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