Ni2+脅迫對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和集胞藻（Synechocystis sp.）的生長和光合色素的影響

趙瑾，常學秀，*，吳程，何玉芹

1.云南大學生命科學學院，昆明650091

2.云南省環(huán)境監(jiān)測中心站，昆明650034

1 引言（Introduction）

重金屬污染對淡水生態(tài)系統(tǒng)的影響日益突出，且容易通過食物鏈產(chǎn)生生物積累和放大效應.藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要成分之一，其生消對水生生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能能夠產(chǎn)生重要影響.水體中重金屬對水生生物的毒害作用早在20世紀50年代開始就備受關注，相繼開展了藻類與金屬相互作用的毒理學、生理學、遺傳學研究.大量的研究成果表明，當水環(huán)境中的重金屬離子達到一定濃度時，就對藻類的生長代謝產(chǎn)生抑制作用，主要表現(xiàn)在：畸變藻類的細胞形態(tài)，阻止細胞分裂，破壞細胞內(nèi)含物，降低酶的活性等（吳紅艷等，2003;Aiken et al.,2003），并表現(xiàn)出隨重金屬濃度的升高，抑制作用增強的總體趨勢.由于光合作用是藻類等光合自養(yǎng)生物的重要生命過程，是決定其生長和繁殖的最重要的生理基礎，因此研究其在污染條件下的變化和響應，是揭示光合生物受害機理的重要內(nèi)容.大量研究表明，重金屬作用下藻類的光合作用受到抑制，光合放氧速率下降（Rodríguez et al.,2007），如 Lu等（2000）發(fā)現(xiàn) Hg對藍細菌的急性毒性主要是抑制了光合作用的光量子產(chǎn)量；3μmol·L-1的 As2O3溶液使魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）光合活性下降為對照的一半（康瑞娟等，2005）；Cd2+脅迫下橢圓小球藻（Chlorellaellip soidea）細胞的光合作用受到明顯抑制，光合放氧速率隨Cd2+濃度的增加而逐漸降低，葉綠素的生物合成受阻，葉綠素b對Cd2+更為敏感（李建宏等，2004）.但目前重金屬影響藻類（特別是形成水華的藍藻）光合作用的進一步機理尚不十分清楚，而且在眾多的重金屬污染物中，對鎳元素的藻類生物學效應關注比較少.以前的研究發(fā)現(xiàn)，鎳（Ni）是生物生長必須的微量元素，但高濃度的Ni能對人類、動物、植物等會產(chǎn)生毒害作用（Poulik,1997）.由于藍藻是藻型富營養(yǎng)化水體生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，重金屬脅迫對藍藻生消的影響及其機理研究對于揭示水華藍藻爆發(fā)的機制具有重要意義.

本文選取富營養(yǎng)化水體中常見的水華藍藻——銅綠微囊藻和藍藻研究模式藻種——集胞藻，研究實驗室條件下Ni2+脅迫對銅綠微囊藻和集胞藻生長的影響，并從藻液的光吸收曲線、光合色素（葉綠素a、藻籃蛋白、別藻藍蛋白）含量等指標入手，探討了重金屬對藍藻生消的影響及其生理機制，為深入研究藍藻在重金屬脅迫下的生理生態(tài)效應及其機理提供基礎數(shù)據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 藻種培養(yǎng)

本研究所用的藻種為銅綠微囊藻（M. aerugonisa）FACHB-905株、集胞藻（Synechocystis sp.）FACHB-680株，均來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB）.采用HGZ-145培養(yǎng)基，置于人工氣候箱恒溫（26±1）℃培養(yǎng)，光照周期為 12:12（h）.實驗設定的 Ni2+處理濃度為5mg·L-1、10mg·L-1、15mg·L-1、20mg·L-1、25mg·L-1，以不加 Ni2+的 0mg·L-1組為對照.分別于處理24h、48h、72h測定各項指標，每項實驗均重復3次.

2.2 藻細胞生物量的測定

參照閻海等（2001）的方法，使用UV755B型分光光度計，自處理開始每隔24h測定藻液在663nm下的光密度（OD663nm）值表示其相對生物量.

2.3 藻細胞光譜特征的測定

采用周志剛和尹長松（2002）的方法，取5mL藻液，使用TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），用HGZ-145空白培養(yǎng)基做參比，在室溫下掃描350nm~800nm范圍內(nèi)藻液的吸收光譜.

2.4 葉綠素a含量的測定

葉綠素a含量的測定參照王永紅等（2001）報道的方法.

2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 10.0軟件進行相關的統(tǒng)計分析和相關性分析.

3 結果（Results）

3.1 Ni2+脅迫對藍藻生長的影響

不同濃度Ni2+處理下M.aerugonisa的生長狀況如圖1所示，不同濃度Ni2+處理下Synechocystis sp.的生長狀況如圖2所示.由圖1可見，M. aerugonisa的生長明顯受到Ni2+的影響.培養(yǎng) 24h后，藻細胞的生物量與Ni2+濃度呈極顯著的負相關關系（R=-0.735，p<0.01），即隨著處理時間的延長，各處理濃度下M.aerugonisa的生物量一直呈下降趨勢，這說明Ni2+對M.aerugonisa的生長有明顯的抑制作用.實驗結果表明（圖2），在處理至24h時，各濃度Ni2+處理下Synechocystis sp.的光密度 OD663值分別比對照增加了 0.52%、1.72%、2.47%、2.86%，其生長沒有受到顯著影響（p>0.05）.但隨處理時間的推移（48h、72h），Synechocystis sp.的生物量逐漸降低，表明 Ni2+處理 48h會對Synechocystis sp.的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用.

3.2 Ni2+對藍藻吸收光譜的影響

不同濃度Ni2+處理下M.aerugonisa的吸收光譜變化規(guī)律如圖 3所示，不同濃度 Ni2+處理下Synechocystis sp.的吸收光譜變化規(guī)律如圖4所示.從圖3、圖4可見，在350nm~800nm光譜范圍內(nèi)，兩種供試藻藻細胞均出現(xiàn)了3個吸收峰，其中約440nm處的波峰為葉綠素a在藍光區(qū)的吸收峰；約630nm處為藻藍蛋白的吸收峰；約680nm處為別藻藍蛋白和葉綠素a在紅光區(qū)的吸收峰.在所有的濃度條件下，Ni2+處理使 M.aerugonisa和Synechocystis sp.藻細胞的光吸收值逐漸降低，說明Ni2+抑制了藻細胞的吸光能力.其中 Ni2+處理24h即對M.aerugonisa的吸光能力產(chǎn)生明顯影響，而Synechocystis sp.則在處理至48h時才產(chǎn)生這種抑制作用.

采用SPSS 10.0軟件分析Ni2+濃度與3種光合色素Chla、PC、APC光吸收峰值的相關性，結果見表 1.由表 1可見，M.aerugonisa和 Synechocystis sp.的Chla、PC、APC光吸收峰值均與Ni2+處理濃度成顯著負相關.其中藻藍蛋白（PC）與Ni2+濃度之間的負相關性最高，表明3種光合色素中受Ni2+影響最大的是PC，其次是APC、Chla.

表1 Ni2+濃度與銅綠微囊藻和集胞藻光合色素的光吸收強度相關性分析Table 1 Correlations between the concentrations of Ni2+and intensity of photosynthetic pigment of M.aerugonisa and Synechocystis sp.Cells

3.3 Ni2+對供試藍藻葉綠素a含量的影響

Ni2+處理下銅綠微囊藻葉綠素a含量的測定結果見圖5，Ni2+處理下集胞藻葉綠素a含量的測定結果見圖6.由圖5可見，M.aerugonisa的葉綠素a含量與Ni2+濃度呈負相關關系.但處理24h時5~ 15mg·L-1的Ni2+對M.aerugonisa葉綠素a含量有一定刺激作用，分別比對照提高 2.13%、4.31%、4.61%，但尚未達到顯著水平（p>0.05）.隨著處理時間的延長，葉綠素a的含量隨Ni2+濃度的增加而迅速下降.由圖6可見，在相同時間內(nèi)，不同濃度Ni2+處理后葉綠素a含量的變化差異顯著，隨著處理濃度的加大，Synechocystis sp.藻細胞葉綠素a含量也相應減少，5~25mg·L-1范圍內(nèi)葉綠素a含量與Ni2+濃度呈現(xiàn)極顯著的負相關關系（R24h=-0.668，p<0.01;R48h=-0.691,p<0.01;R72h=-0.709,p<0.01）.

4 討論（Discussion）

在供試劑量的Ni2+處理下，銅綠微囊藻的生長受到抑制，隨著Ni2+濃度的增加和處理時間的延長，抑制作用越明顯；在處理至24h時，集胞藻的生長尚未受到Ni2+的抑制，但處理至48h后呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，且脅迫濃度越大、脅迫時間越長，抑制作用越明顯，表現(xiàn)出明顯的“劑量-效應”和“時間-效應”關系，Carrieri等（2008）的研究也表明Ni2+能抑制藍藻生長，并導致葉綠素降解.光合作用是藻類等光合自養(yǎng)生物的重要生命過程，是決定其生長和繁殖的最重要的生理基礎，葉綠素a（Chl a）、藻藍蛋白（PC）和別藻藍蛋白（APC）是藍藻常見的3種重要的光合色素，其中PC和APC統(tǒng)稱為藻膽蛋白，它們共同構成了藍藻的捕光天線系統(tǒng)，光能在藻膽體中傳遞的順序為PC→APC，最后傳給光合作用反應中心 Chl a（Arteni et al., 2009）.藻膽體主要通過藻膽體大小、結構及數(shù)量的改變對環(huán)境作出響應（Reuter and Müller,1993），如氮饑餓能導致集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803藻膽體在相關基因控制下主動降解（Sato et al., 2008）.有報道指出，在藍藻的類囊體膜上，由于藻膽體顆粒位于外表面，因而更易受到進入細胞內(nèi)的重金屬離子的作用（李建宏等，1997）.根據(jù)本文實驗結果，3種光合色素對Ni2+脅迫的敏感性大小依次為PC＞APC＞Chl a，由此表明藻藍蛋白（PC）是Ni2+的首要作用位點，王山彬等（2002）的研究也得到了類似的結果.但本課題組針對水生植物化感克藻效應及其機理的研究中發(fā)現(xiàn)，M.aerugonisa的APC對粉綠狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）分泌的化感物質(zhì)更為敏感、更易于受損，即APC是粉綠狐尾藻對M.aerugonisa光合系統(tǒng)的化感抑制靶位點（Wu et al.,2008）.這可能是由于不同環(huán)境因子對藻膽體的影響機制存在差異，且該過程受其它共存生態(tài)因子的影響和制約，如 Carrieri等（2008）發(fā)現(xiàn)光照強度顯著地影響著Ni2+對極大螺旋藻（Arthrospira maxima）生長及葉綠素含量的影響：高光通量（100μE·m-2·s-1）下0.17、1.7、3.4、和5.0mM Ni2+處理3天后導致藻細胞生長緩慢、脫綠及黃化，且濃度越高抑制作用越強，而在低光通量（40μE·m-2·s-1）下，4.0mM Ni2+在處理初期使得葉綠素略有下降，但12d后恢復到不加鎳的對照水平.

綜上所述，重金屬可以通過破壞藻細胞的捕光天線系統(tǒng)，阻斷藻膽蛋白對光電子的捕獲和傳遞，從而抑制光合作用，最終抑制藍藻的生長和繁殖.而且隨鎳脅迫劑量的加大和脅迫時間的延長，藍藻葉綠素a含量不斷減少.光合色素含量和功能的降低必然導致其光合能力的下降，從而抑制藻細胞的生長，導致生物量不斷降低.

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