鵝細小病毒NS1蛋白的原核表達及間接ELISA方法的建立

孫敏華，董嘉文，李林林，袁建豐，鄺瑞歡，胡奇林，張建峰

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣州 510640）

研究論文

鵝細小病毒NS1蛋白的原核表達及間接ELISA方法的建立

孫敏華，董嘉文，李林林，袁建豐，鄺瑞歡，胡奇林，張建峰

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣州 510640）

本研究克隆了鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）佛山株（Foshan-2009）的NS1基因，并將其克隆至原核表達載體pET32a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-NS1。經(jīng)轉(zhuǎn)化，IPTG誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE和Western blot分析表明，NS1蛋白得到了表達，并且能與抗GPV的番鴨血清發(fā)生特異性反應(yīng)。通過棋盤法確定NS1蛋白包被量為0.5 μg/孔，待檢血清1:50稀釋，HRP標記的兔抗鴨二抗1:10 000倍稀釋時ELISA反應(yīng)條件最佳，并確定陰陽性臨界值為0.399。該ELISA方法特異性強，與番鴨細小病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、新城疫病毒和鴨疫里默氏桿菌的陽性血清均無交叉反應(yīng)；重復(fù)性好，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)分別小于5%和10%；檢出率高，GPV陽性番鴨血清的檢出率為92%。本研究所建立的間接ELISA方法為鵝細小病毒的血清學診斷和流行病學監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。

鵝細小病毒；NS1 蛋白；ELISA

鵝細小病毒病或稱小鵝瘟，是由鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性敗血性傳染病[1]。該病于1956年由方定一教授首次在江蘇省揚州市發(fā)現(xiàn)。GPV主要侵害3～20日齡的雛鵝和雛番鴨，傳播快，發(fā)病率和死亡率較高，特征表現(xiàn)為水樣腹瀉，滲出性腸炎，甚至臘腸樣栓塞[2]。

GPV基因組長約5.1 kb，可編碼5種蛋白，包括2種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）和3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2和VP3）。NS1和NS2蛋白在病毒復(fù)制早期產(chǎn)生，其中NS1 基因含有1884個核苷酸，編碼628個氨基酸，NS1 蛋白參與病毒對細胞的毒性作用、病毒復(fù)制及基因表達[3,4]。目前，基于NS1蛋白的血清學檢測方法研究較少[5-7]，因此本研究利用pET32a（+）成功表達NS1蛋白，隨后利用重組表達蛋白作為包被抗原，建立了GPV-NS1間接ELISA 抗體檢測方法，為鵝細小病毒病的診斷以及血清學調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株、質(zhì)粒和試劑GPV分離株、GPV弱毒疫苗免疫陽性血清、Rosseta感受態(tài)細胞和pET32a（+）質(zhì)粒由本實驗室鑒定、保存；BamHI、XhoHII、T4DNA連接酶和MiniBest病毒RNA/DNA抽提試劑盒購于寶生物工程有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物科技公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購于Fermentas公司；兔抗鴨IgG購自Nordic公司；OPD購自北京鼎國生物技術(shù)公司；大腸桿菌工程菌株DH5α、Rosetta、pET32a(+)為本實驗室保存。

1.2 引物及NS1基因的PCR擴增根據(jù)GenBank中GPVNS1基因的ORF序列，利用Oligo6.0設(shè)計了擴增NS1基因的引物，預(yù)期擴增片斷為1884bp。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，NS1-U：GGATCCATGGCACTTTCTAGGCCTC（BamHI），NS1-L：CTCGAGTTATTGTTCATTTTCAGCATC（XhoI）。參考文獻[8]進行PCR擴增并回收目的片段。

1.3 NS1蛋白的表達、純化及Westernblot檢測參考文獻[8,9]中的方法進行pET32a-NS1載體構(gòu)建，并用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)陽性菌蛋白表達，隨后進行蛋白可溶性分析，利用Ni-NTAHis·Bind（Novagen）進行蛋白純化及Westernblot檢測。

1.4 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定用棋盤方陣滴定法，將純化后的NS1蛋白用0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液從80μg/mL依次進行倍比稀釋（80、40、20、10、5、2.5μg/mL），每孔100μL包被酶標板，4℃包被過夜。然后棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗3次后，加入含0.2%明膠的PBST37℃封閉1h。陽性血清和陰性血清分別按1:50、1:100進行倍比稀釋，37℃作用1h后，洗滌3次，再加入1:10000稀釋的兔抗鴨二抗，37℃作用1h，洗滌3次后拍干。加入新鮮配制的OPD底物顯色液，作用10min，再加入2mol/L硫酸50μL/孔終止反應(yīng)，用酶標儀測定OD490值。

1.5 間接ELISA陰性和陽性臨界值的確定用上述建立的間接ELISA方法，對實驗室保存的56份番鴨GPV陰性血清進行檢測，根據(jù)OD490值計算樣本的平均值（x）和標準方差（s）。依照統(tǒng)計學原則，樣本的OD490值＞陰性樣本OD平均值（x）+3×s（標準方差）時，可以在99.9%的水平上判定為陽性。

1.6 特異性試驗用建立的ELISA方法分別檢測番鴨細小病毒（Muscovyduckparvovirus，MPV）、鴨瘟病毒（Duckenteritisvirus，DEV）、鴨肝炎病毒（Duckhepatitisvirus，DHV）、新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）和鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA）陽性血清，以驗證本試驗建立的間接ELISA方法是否與其他病毒或細菌的陽性血清存在交叉反應(yīng)。

1.7 敏感性試驗按最佳反應(yīng)條件進行試驗，將GPV陽性血清按1:50～1:400倍比稀釋，其余條件按1.4 中最佳反應(yīng)條件進行。

1.8 重復(fù)性試驗批內(nèi)重復(fù)性試驗：用建立的間接ELISA方法測定3份GPV陽性番鴨血清和3份GPV陰性番鴨血清，在最佳反應(yīng)條件下每份血清在同一塊NS1蛋白包被的酶標板上進行反應(yīng)，每份血清平行進行3次重復(fù)，根據(jù)每份血清的OD490值計算出平均值和標準差，再計算出每份血清OD490值的板內(nèi)變異系數(shù)。批間重復(fù)性試驗：將NS1蛋白按最佳包被濃度包被ELISA板，不同時間進行3次試驗，分別對3份GPV陽性血清和3份陰性血清進行間接ELISA檢測，結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

1.9 間接ELISA方法的臨床應(yīng)用用建立的ELISA方法檢測本實驗室采集的種番鴨群免疫GPV的陽性血清樣品88份，計算陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 NS1基因的擴增及其表達片化鑒定經(jīng)PCR擴增后，1%凝膠電泳檢測可見與預(yù)期片斷（1884 bp）相符的DNA條帶（結(jié)果未顯示）。經(jīng)序列測定后證實為GPV NS1基因，其與GPV LN-1/06分離株的NS1基因相似性高達99%（結(jié)果未顯示）。

將擴增目的片段克隆入pET32a(+)載體，成功構(gòu)建pET32a-NS1載體。將鑒定正確的pET32a-NS1陽性菌經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析表明，約在92 kDa處出現(xiàn)一條與NS1蛋白預(yù)期表達大小相符合的蛋白條帶，而未誘導(dǎo)菌無表達。經(jīng)可溶性分析表明，該蛋白以包涵體形式存在。隨后，利用鎳柱進行了蛋白純化（圖1），Western blot結(jié)果顯示，該重組蛋白能與GPV陽性血清反應(yīng)（圖2），表明所表達的NS1蛋白抗原性良好。

圖1 pET32a-NS1重組蛋白純化后SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purif ed recombination protein pET32a-NS1

圖2 pET32a-NS1重組蛋白免疫印跡分析Fig.2 Western blot analysis of pET32a-NS1

2.2 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定方陣滴定顯示，當血清的稀釋度為1:50，抗原包被量為0.5 μg/孔時（表1），陽性血清的OD490值可達0.932，而對應(yīng)孔陰性血清的OD490值為0.190，陰性與陽性血清的OD490比值大（P/N=4.905），且陽性血清OD值最接近1。因此，選擇1:50為最佳血清稀釋度，0.5 μg /孔為抗原的最佳包被量。

2.3 間接ELISA陰陽性臨界值的確定對36份GPV陰性血清進行間接ELISA檢測，其平均值x為0.234，標準差s為0.055。根據(jù)公式：陰陽性臨界值=x+3×s，試驗臨界值為0.399。即待測樣品的OD490值≥0.399時為陽性，OD490值＜0.399則為陰性。

2.4 特異性試驗用建立的間接ELISA方法對GPV、MPV、DEV、DHV、NDV和RA的陽性血清進行測定，其OD490值如表2所示，這些血清的OD490值均小于陰陽性臨界值0.399。

2.5 敏感性試驗按最佳條件進行包被，將GPV陽性血清分別1:50～1:400倍比稀釋后，進行間接ELISA。結(jié)果顯示，當陽性血清1:200稀釋時，其OD值仍然大于0.399（表3），因此該方法的敏感性大于1:200。

2.6 重復(fù)性試驗批內(nèi)重復(fù)性試驗：將6份GPV血清（陽性血清3份，陰性血清3份）用同一批包被的酶標板檢測，重復(fù)3孔，計算同一批次3次重復(fù)的變異系數(shù)。結(jié)果表明試驗中變異系數(shù)最大值約為4.5%，最小值約為1.7%（表4）。批間重復(fù)性試驗：取不同時間包被的ELISA板，分別進行3次試驗，計算3個不同批次間的變異系數(shù)。結(jié)果表明該方法的批間變異系數(shù)最大值約為9.5%，最小值約為3.0%（表4）。

表1 棋盤法確定NS1蛋白最佳包被濃度和血清稀釋度Table 1 The optimization of NS1 protein coating concentration and serum dilution by checkerboard titration

表2 間接ELISA方法的特異性試驗結(jié)果Table 2 Specif city test of the indirect ELISA

表3 間接ELISA方法的敏感性試驗結(jié)果Table 3 Sensitivity test of the indirect ELISA

表4 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 Repetition test of the indirect ELISA based on NS1 protein

2.7 間接ELISA方法的臨床應(yīng)用用建立的ELISA方法檢測本實驗室采集的種番鴨群抗GPV陽性血清樣品88份，OD490值≥0.399時判定為陽性。測得免疫后番鴨群血清陽性樣品81份，陽性率為92.0%。

3 討論

鵝細小病毒主要侵害雛鵝和雛番鴨，其死亡率隨日齡增長而下降[1]。由于該病發(fā)病日齡早，因此免疫種禽使幼雛獲得母源抗體以抵抗病毒感染是目前常用的手段。盡管如此，小鵝瘟仍然時有發(fā)生，這可能與目前免疫覆蓋率不足以及母源抗體降低等因素有關(guān)，因此監(jiān)測弱毒疫苗免疫后母源抗體的水平顯得尤為重要。Wang等[7]建立了基于GPV的VP3和NS1蛋白的Western blot檢測方法，并將所檢測的田間血清分為4組。結(jié)果顯示，除無反應(yīng)組外，其余3組均與NS1蛋白存在免疫反應(yīng)，所檢測的抗體陽性率為94.7%。這說明NS1蛋白的抗體是感染GPV后最早出現(xiàn)的，且持續(xù)時間長，因此其抗體比較適合用于抗體檢測。

目前，基于GPV NS蛋白和VP3蛋白建立的相關(guān)檢測方法較多。Zhang等[10]用pET30a（+）成功表達了GPV的VP3蛋白，用重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板后，臨床樣本檢測結(jié)果表明該方法與病毒中和試驗方法符合率在87%以上。尚緒增等[6]建立針對NS2蛋白的間接ELISA方法，與瓊脂擴散試驗結(jié)果的陽性符合率為100%。與病毒中和和瓊脂擴散相比，ELISA方法最大的優(yōu)勢就是適合大規(guī)模樣品的檢測，尤其是NS蛋白與瓊脂擴散試驗結(jié)果符合率較高。本研究建立的ELISA方法特異性強，與MPV、DEV、DHV、NDV和RA的陽性血清均無交叉反應(yīng)；重復(fù)性好，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)分別小于5%和10%；臨床應(yīng)用前景廣，番鴨陽性血清樣品檢出率為92%。該方法可以為鵝細小病毒的血清學診斷和流行病學監(jiān)測提供有力保障。

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DEVELOPMENT OF AN INDIRECT ELISA ASSAY USING PROKARYOTICALLY EXPRESSED NS1 PROTEIN OF GOOSE PARVOVIRUS

SUN Min-hua, DONG Jia-wen, LI Lin-lin, YUAN Jian-feng, KUANG Rui-huan, HU Qi-lin, ZHANG Jian-feng
(Guangdong Open Laboratory of Public Health, Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

The NS1 gene of GPV Foshan-2009 was amplif ed in PCR and cloned into pET32a(+) vector. The recombinant NS1 protein was expressed with induction of IPTG and analyzed in SDS-PAGE and Western blot. The expressed NS1 protein reacted well with the positive Muscovy duck serum against GPV. Then, an indirect ELISA assay was developed using the recombinant NS12 protein. The assay factors were determined using the Checkboard method, including coating NS1 protein at 0.5 μg/well, test serum dilution at 1:50 and conjugated antibody HRP dilution at 1:10 000. The assay was optimized with a cut-off value of 0.399. The cross testing demonstrated that the indirect ELISA had no reaction with positive sera against Muscovy duck parvovirus, Dnck virus, Dnck hepatitis virus, Newcastle disease virus andRiemerella anatipestifer.The intra- and inter-coeffcients of variabilities were 5% and 10%, respectively, suggesting its reproducibility and repeatability. Clinical testing showed that 92% positive rate was obtained with f eld samples. In conclusion, this indirect ELISA could be used for serological detection and surveillance of Goose parvovirus.

Goose parvovirus; NS1 protein; ELISA

S858.332.659.2

A

1674-6422（2014）06-0001-05

2014-08-05

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003012）；廣東省科技計劃項目（2012B050500013，2011B050700007）

孫敏華，男，助理研究員，主要從事禽病病毒學研究

胡奇林，E-mail：hql562713@163.com；張建峰，E-mail：zhang-jianfeng@139.com