抗氧化劑對(duì)急性肺損傷大鼠細(xì)胞因子的影響研究*

劉 薇 張 慧 常 誠(chéng) 林書(shū)祥 趙津生 鄭 捷 黃敬孚

抗氧化劑對(duì)急性肺損傷大鼠細(xì)胞因子的影響研究*

劉 薇 張 慧△常 誠(chéng) 林書(shū)祥 趙津生 鄭 捷 黃敬孚

目的：探討急性肺損傷（ALI）的發(fā)病機(jī)制及抗氧化劑對(duì)ALI大鼠細(xì)胞因子的影響。方法：健康、成熟Wistar大鼠60只隨機(jī)平均分為模型組和治療組，2組均以大腸桿菌腹腔注射，建立ALI動(dòng)物模型。治療組在注射大腸桿菌30 min后，經(jīng)大鼠尾靜脈注射還原型谷胱甘肽。分別于注射大腸桿菌后3、6、12 h測(cè)定2組血中IL-8、IL-10的變化。結(jié)果：模型組注射大腸桿菌后3 h出現(xiàn)ALI癥狀，6 h更為明顯，12 h口吐粉紅色分泌物，解剖后肉眼所見(jiàn)雙肺有明顯水腫及出血點(diǎn)，氧合指數(shù)及肺濕/干重比均達(dá)到ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)。治療組3 h無(wú)明顯變化，6 h呼吸稍促，12 h肺組織僅輕度水腫。在使用還原型谷胱甘肽后，治療組肺濕/干重比各時(shí)段檢測(cè)值均低于模型組，其中6、12 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IL-8檢測(cè)值各時(shí)段均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IL-10檢測(cè)值各時(shí)段均高于模型組，6、12 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：ALI時(shí)存在炎性介質(zhì)的失控與失衡，應(yīng)用還原型谷胱甘肽后可有效調(diào)控炎性介質(zhì)，從而降低ALI的發(fā)生概率。

呼吸窘迫綜合征,成人 疾病模型,動(dòng)物 谷胱甘肽 白細(xì)胞介素8 白細(xì)胞介素10 細(xì)胞因子類(lèi)大鼠,Wistar

急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是常見(jiàn)危重癥，病死率極高，其基本病理生理改變是肺泡上皮和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮通透性增加所致的非心源性肺水腫，在疾病發(fā)展過(guò)程中有多種細(xì)胞因子參與[1]。還原型谷胱甘肽主要存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，對(duì)維持細(xì)胞的正常代謝，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性具有重要的生化功能作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立ALI動(dòng)物模型，檢測(cè)其在應(yīng)用抗氧化劑（還原型谷胱甘肽）前后炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）－8、IL－10表達(dá)的變化，探討抗氧化劑對(duì)ALI細(xì)胞因子的影響效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康、成熟Wistar大鼠60只，購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，雌雄各30只。隨機(jī)分為2組，模型組30只，雌雄各15只，平均體質(zhì)量（198.4±12.7）g，平均（4.20±0.13）月齡；治療組30只，雌雄各15只，平均體質(zhì)量（196.8±12.1）g，平均（4.19±0.13）月齡。2組平均體質(zhì)量（t=0.499 6）、月齡（t=0.2）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）儀器與試劑。美國(guó)NOVA PHOX全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x，大腸桿菌（O11B4，美國(guó)Sigma公司），還原型谷胱甘肽（積華藥業(yè)有限公司），烏拉坦（武漢銀河化工有限公司），福爾馬林（江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

1.2方法 模型組和治療組均以大腸桿菌2 mL/kg腹腔注射，以氧合指數(shù)[p（O2）/FiO2]≤300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、肺濕/干重比、肺組織病理改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)，成功建立ALI動(dòng)物模型[3]。治療組在注射大腸桿菌30 min后，經(jīng)大鼠尾靜脈注射還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）800 mg/kg。各組內(nèi)大鼠每10只為一批分別在注射大腸桿菌后3、6、12 h，用烏拉坦麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，即刻送血?dú)夥治觯溆嗖糠蛛x心保存。大鼠氣管插管，用生理鹽水做肺灌洗，回收率90%，回收液離心保存，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法測(cè)定血中IL-8、IL-10的變化。大鼠處死后取右肺下葉組織于10%福爾馬林液中固定，左肺稱(chēng)體質(zhì)量，并自然干后再稱(chēng)體質(zhì)量，計(jì)算肺濕/干重比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般情況比較 注射大腸桿菌后，模型組大鼠3 h組出現(xiàn)呼吸稍促、寒戰(zhàn)、毛發(fā)潮濕現(xiàn)象，6 h組上述現(xiàn)象更為明顯，12 h組口吐粉紅色分泌物，解剖后肉眼可見(jiàn)雙肺有明顯水腫及出血點(diǎn)，氧合指數(shù)及肺濕/干重比均達(dá)到ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)；治療組大鼠3 h組無(wú)明顯變化，6 h組呼吸稍促，12 h組肺組織僅輕度水腫。

2.2肺濕/干重比檢測(cè)結(jié)果 治療組大鼠肺濕/干重比在3、6、12 h時(shí)檢測(cè)值均低于相應(yīng)模型組，6、12 h時(shí)2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠肺濕/干重比檢測(cè)結(jié)果比較

表1 2組大鼠肺濕/干重比檢測(cè)結(jié)果比較

*P ＜ 0．05，表 2、3 同

組別治療組模型組t n 10 10 3 h 6.88±1.98 7.77±1.71 1.07 6 h 5.90±1.00 9.18±4.13 2.44*12 h 7.03±1.50 10.66±1.72 5.03*

2.3IL-8、IL-10檢測(cè)結(jié)果 治療組 3、6、12 h時(shí)IL-8值低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表 2。治療 3、6、12 h 時(shí) IL-10 值高于模型組，6、12 h 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表 3。

表2 2組大鼠IL-8檢測(cè)結(jié)果比較

表2 2組大鼠IL-8檢測(cè)結(jié)果比較

組別治療組模型組t n 10 10 3 h 8.93±0.81 10.52±0.71 4.67*6 h 8.73±1.08 10.72±0.99 4.28*12 h 9.70±1.06 11.56±1.09 3.89*

表3 2組大鼠IL-10檢測(cè)結(jié)果比較

表3 2組大鼠IL-10檢測(cè)結(jié)果比較

組別治療組模型組t n 10 10 3 h 0.37±0.35 0.25±0.11 1.05 6 h 0.48±0.30 0.26±0.07 2.33*12 h 0.29±0.10 0.17±0.09 2.78*

2.4病理觀察 模型組大鼠注射大腸桿菌后，肺泡上皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。其3 h（早期）表現(xiàn)以肺泡高滲出性水腫為特點(diǎn)，見(jiàn)圖1；6 h（中期）出現(xiàn)肺泡間隔增寬、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2；12 h（晚期）Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞沿肺泡腔間隔增生，纖維原細(xì)胞增殖，肺泡內(nèi)出血、過(guò)度充氣及部分肺泡破裂，見(jiàn)圖3，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、局部肺實(shí)變，見(jiàn)圖4。治療組ALI大鼠3、6、12 h肺組織基本正常，病理變化輕微，見(jiàn)圖5。

圖1 模型組3 h肺泡高滲出性水腫（HE×400）

圖2 模型組6 h肺泡間隔增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×400）

圖3 模型組12 h過(guò)度充氣，部分肺泡破裂融合（HE×100）

圖4 模型組12 h炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部肺實(shí)變（HE×100）

圖5 治療組肺組織均基本正常（HE×100）

3 論討

細(xì)胞因子和趨化因子是一類(lèi)生物活性多樣的活性蛋白，可促進(jìn)局部和全身的炎癥反應(yīng)。既往研究表明，ALI既是全身炎性反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)，也是機(jī)體正常炎性反應(yīng)過(guò)度的結(jié)果，肺血管通透性增加與過(guò)度或失控性炎癥反應(yīng)有關(guān)，炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)構(gòu)成了ALI炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”和“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”[4]。在炎癥反應(yīng)中，促炎性介質(zhì)與抗炎性介質(zhì)經(jīng)常處在平衡、失衡相互對(duì)立統(tǒng)一的變化之中，因而，深入研究促炎因子和抗炎因子在炎性反應(yīng)中的變化規(guī)律有助于對(duì)ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)[5]。

IL-8又名中性粒細(xì)胞趨化因子，屬于促炎性介質(zhì)，是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和T細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種多肽因子，主要參與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過(guò)程。IL-10是抗炎因子的關(guān)鍵，具有廣泛的生物學(xué)活性，在肺中具有抗感染作用，能抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，故被認(rèn)為是機(jī)體限制內(nèi)源性反應(yīng)的內(nèi)源性機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的細(xì)胞因子IL-8呈增高趨勢(shì)，IL-10呈降低趨勢(shì)，證實(shí)ALI時(shí)存在炎性介質(zhì)的失控與失衡。因此，筆者認(rèn)為如果可以有效抑制IL-8的分泌，提高IL-10的活性，就可能從調(diào)控細(xì)胞炎性因子著手干預(yù)ALI的發(fā)生和發(fā)展。

谷胱甘肽（glutathione）廣泛分布于人體肝、腎細(xì)胞和紅細(xì)胞，由GSH和氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）組成，兩種形式可以互變[6]。ALI時(shí)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，肺組織細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化失衡，如GSH氧化還原系統(tǒng)表現(xiàn)為GSH氧化型增加而還原型減少，GSH在血中、肺泡上皮襯液及肺部其他細(xì)胞中含量降低[7]，同時(shí)亦有文獻(xiàn)報(bào)道顯示GSH對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷具有一定保護(hù)作用，并認(rèn)為其作用機(jī)制可能與氧化、凋亡有關(guān)[8]。

本研究顯示，治療組大鼠IL-8檢測(cè)值各時(shí)段皆低于模型組，且差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-10檢測(cè)值各時(shí)段皆高于模型組，在6、12 h差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示應(yīng)用GSH可有效調(diào)控炎性介質(zhì)，降低ALI的發(fā)生率。鑒于目前ALI的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，ALI的發(fā)病機(jī)制及抗氧化劑對(duì)ALI的其他影響有待進(jìn)一步研究。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì).急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南（2006）[J].中國(guó)實(shí)用外科雜志，2007，27（1）:1-6.

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Effect of Anti-Oxidant on Cytokines of Acute Lung Injury in Rats

LIU Wei,ZHANG Hui,CHANG Cheng,LIN Shuxiang,ZHAO Jinsheng,ZHENG Jie,HUANG Jingfu

Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300074，China

Objective：To investigate the pathogenesis of acute lung injury(ALI),and the effect of anti-oxidants on cytokines of ALI in rats.Methods：Sixty Wistar rats were randomly divided into 2 groups,the model group and the treatment group.The animal model of ALI was established by intraperitoneal injection of Escherichia（E.）coli.The anti-oxidant,reduced glutathione,was injected by the rat tail vein 30 min after injection of E.coli in rats of treatment group.The levels of serum IL-8 and IL-10 were detected 3,6 and 12 h after injection of E.coli.Results：The symptom of ALI appeared 3 h after injection of E.coli,and was more serious after 6 h in rats of the model group.There were anatomical lung edema and bleeding points 12 h after injection of E.coli in rats of the model group.The oxygenation index and lung wet/dry weight ratio reached the diagnostic criteria of ALI.There was no significant change after 3 h,rapid breath after 6 h and only mild lung edema after 12 h in rats of the treatment group.The value of lung wet/dry weight ratio was lower in rats of treatment group than that of model group,which was significantly different after 6 and 12 h treatment(P<0.05).The levels of IL-8 w ere lower at various time points in treatment group than those of model group(P<0.05).The levels of IL-10 were significantly higher at different detection time points in treatment group than those of model group (P<0.05).Conclusion：There was an imbalance and uncontrol of inflammatory mediators in acute lung injury.After application of reduced glutathione,inflammatory mediators can be effectively controlled,thereby reducing the occurrence probability of the acute lung injury.

respiratory distress syndrome,adult disease models,animal glutathione interleukin-8 interleukin-10 cytokines rats,Wistar

*天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：02KZ14）

300074 天津市兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)病房△

E-mail：chui853@yahoo.com.cn

（2010-03-30收稿 2010-05-25修回）

（本文編輯 陸榮展）

短篇論著