殼寡糖接枝葡萄糖產(chǎn)物的抗氧化性研究

林家超,王 巍,汪連生,覃彩芹

(孝感學(xué)院生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北孝感432000)

殼寡糖接枝葡萄糖產(chǎn)物的抗氧化性研究

林家超,王 巍,汪連生,覃彩芹

(孝感學(xué)院生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北孝感432000)

殼寡糖與葡萄糖反應(yīng),在p H 2.9～11.0內(nèi),堿性增加,反應(yīng)加快;在40～95℃內(nèi),溫度升高,反應(yīng)加快。所得接枝產(chǎn)物溶于水,比殼寡糖有更強(qiáng)的抗氧化能力。

殼寡糖;葡萄糖;接枝;抗氧化作用

甲殼素是自然界僅次于纖維素的第二大天然高分子多糖,廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、原生動(dòng)物、腔腸動(dòng)物及真菌和藻類的細(xì)胞壁中。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物,市售產(chǎn)品主要來(lái)源于蝦蟹殼[1]。殼聚糖可溶于某些酸溶液中,但不溶于中性介質(zhì),影響其在體內(nèi)的消化與吸收,使它的一些生理活性發(fā)揮受到限制。殼寡糖是殼聚糖經(jīng)酶降解后得到的低分子量產(chǎn)物[2],具有水溶性好、易被動(dòng)物體吸收的特點(diǎn),有更好的增強(qiáng)免疫能力、調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿平衡、抗氧化的功效[3-4]。但是,由于殼寡糖本身分子中含有氨基和還原半縮醛基,易于相互反應(yīng),致使殼寡糖在氣溫較高的空氣中易變成棕黑色[5],失去水溶性和生理活性。因而,本文采用葡萄糖與殼寡糖反應(yīng),制備殼寡糖接枝葡萄糖產(chǎn)物,并研究它們的抗氧化活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

殼聚糖,分子量52.5萬(wàn),脫乙酰度90.5%,浙江金殼生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品;α-淀粉酶,北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品;其他試劑為分析純。

1.2 樣品的測(cè)定

以凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)定殼寡糖分子量:TSKG-5000和 TSKG-3000聯(lián)柱,RI-101示差檢測(cè)器,在 TSP P1000高效液相色譜儀上測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)樣品為已知分子量的 TOSOH Pulluan,流動(dòng)相為0.2mol/L CH3COOH/0.1mol/L CH3COONa溶液,流速為1.0 mL/min,數(shù)據(jù)由JS-3050江申色譜工作站處理。

紅外光譜 IR:Nicolet Impact 380紅外光譜儀,KBr壓片。

1.3 殼寡糖的制備

20g殼聚糖溶解在500mL的1%(w/w)醋酸溶液,攪拌0.5h后,調(diào)節(jié)溫度為48℃,加入0.4g α-淀粉酶,持續(xù)攪拌6h,然后把溶液放入沸水中煮10 min,離心,棄去不溶物,然后濾液減壓濃縮至約150mL,調(diào)p H值為9,用無(wú)水乙醇沉淀,離心,乙醇洗滌,用五氧化二磷干燥備用。

1.4 不同條件對(duì)反應(yīng)的影響

時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響:0.2 g殼寡糖在20 mL水中溶解完全后,加入0.2 g葡萄糖,p H為6.5,于 75 ℃反應(yīng) ,在 0、1、2、3、4、5 h 分別取樣用分光光度計(jì)測(cè)定溶液在340nm處的吸光度值。

p H值對(duì)反應(yīng)的影響:0.5 g殼寡糖在35m L水中溶解完全后,加入0.5 g葡萄糖,分別取4m L溶液加入8支刻度試管中,用 HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值,每支試管定容為5mL,于57℃反應(yīng)1h,用分光光度計(jì)測(cè)定溶液在340nm處的吸光度值。

溫度對(duì)反應(yīng)的影響:0.3 g殼寡糖在20mL水中溶解完全后,加入0.3 g葡萄糖,p H為6.5,分成6份,于不同溫度下反應(yīng)1h,用分光光度計(jì)測(cè)定溶液在340 nm處的吸光度值。

1.5 接枝產(chǎn)物的制備

分別稱取 2份3.0 g殼寡糖,各自溶解于30m L水中,分別加入1.5g和3.0g葡萄糖,調(diào)節(jié)p H值為9,60℃攪拌5h后,減壓濃縮,用無(wú)水乙醇沉淀,洗滌,用五氧化二磷干燥,得到接枝產(chǎn)物COS-G1和COS-G2。

1.6 抗氧化性

用緩沖溶液配制濃度分別為3×10-2、18×10-5、225×10-5mol/L的蛋氨酸、核黃素、氯化硝基四氮唑蘭溶液,依次各取以上溶液0.5m L于反應(yīng)管中,并向反應(yīng)管中分別加入0.5mL殼寡糖和接枝產(chǎn)物水溶液(濃度為0.5,1.0,2.0,4.0 mg/mL),再加1m L蒸餾水,混合均勻后,將反應(yīng)管在恒定光強(qiáng)日光燈下照射30min,用分光光度計(jì)在560nm處測(cè)定各樣品的吸光度,各樣品重復(fù)測(cè)定3次。清除率的計(jì)算式可表示為:清除率 =[(A0-A)/A0]×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼寡糖的分子量

圖1所示為殼聚糖原料和降解后的殼寡糖產(chǎn)物的 GPC圖。與殼聚糖原料峰相比,殼寡糖峰向著洗脫體積增大的方向移動(dòng)。所測(cè)殼寡糖樣品平均分子量為1582。

圖1 殼聚糖原料CS和殼寡糖COS的 GPC

2.2 反應(yīng)條件的影響

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),溶液顏色加深,吸光度值增加。從表1可以看出,吸光度1h內(nèi)增加較大,1h至5h吸光度值增加緩慢。說(shuō)明在1h內(nèi)反應(yīng)已基本完成,殼寡糖中的氨基與葡萄糖中的醛基容易反應(yīng)。

表1 不同時(shí)間的反應(yīng)液的吸光度值

從表2可以看出,吸光度值隨著p H值的增加而增加,說(shuō)明反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行時(shí),有利于氨基進(jìn)攻醛基。

表2 不同p H值的反應(yīng)液的吸光度值

從表3可以看出,隨著反應(yīng)溫度的升高,反應(yīng)液的吸光度值增大,說(shuō)明隨著溫度的升高,反應(yīng)速度加快。

表3 不同溫度下的反應(yīng)液的吸光度值

2.3 接枝產(chǎn)物的紅外光譜圖

圖2為殼寡糖和接枝產(chǎn)物的紅外光譜圖。殼寡糖在1634和1561 cm-1處的峰分別為殼寡糖中酰胺I和酰胺 II的譜帶。參照酰胺 II譜帶,接枝產(chǎn)物在1640 cm-1處的峰明顯增強(qiáng),為酰胺 I譜帶和新生成C=N對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰的疊加峰[6]。

2.4 美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基的清除

圖2 殼寡糖COS和接枝產(chǎn)物COS-G2的紅外光譜

用光照核黃素的方法產(chǎn)生O2-·,可以使氯化硝基四氮唑蘭產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì),該物質(zhì)在560 nm處有最大吸收峰。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,藍(lán)色物質(zhì)的生成就越多,加入殼寡糖可使O2-·的量降低,進(jìn)而藍(lán)色物質(zhì)的生成減少,因此,測(cè)定該波長(zhǎng)下的吸光度值的變化,可反映殼寡糖和接枝產(chǎn)物對(duì)O2-·的清除能力。

圖3 殼寡糖與葡萄糖接枝產(chǎn)物對(duì)光照核黃素產(chǎn)生超氧陰離子自由基的清除作用

由圖3可見,殼寡糖和接枝產(chǎn)物清除超氧陰離子的能力隨濃度的增加而增強(qiáng),同一濃度時(shí),COS-G2的清除率大于COS-G1,兩者都大于COS,說(shuō)明殼寡糖與葡萄糖接枝后的產(chǎn)物具有更好的抗氧化性。

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Preparation and An tioxidation of Glucose-grafted Chitooligomers

Lin Jiachao,Wang Wei,Wang Liansheng,Qin Caiqin
(H ubei Key Laboratory of Biomass-Resource Chem istry and Environmental Biotechnology,Xiaogan University,Xiaogan,Hubei 432000,China)

Chitooligomers reacted with glucose.The reaction rate increased with the increased pH in the range of p H 2.9～11.0.The reaction rate increased with the increased temperature in the range of 40～95℃.The obtained products were soluble in water,and had stronger antioxidation than the chitooligomers.

chitooligomers;glucose;graft;antioxidation

O636.11

A

1671-2544(2010)03-0005-03

2010-03-30

湖北省教育廳科學(xué)研究重大項(xiàng)目(Z200626001)

林家超(1985— ),男,湖北武漢人,孝感學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院2008屆本科畢業(yè)生。

覃彩芹(1965— ),男,湖北赤壁人,孝感學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授,博士。

(責(zé)任編輯:鄒禮平)