野生曲莖石斛的離體培養(yǎng)及再生體系研究

余曉麗,王世茹,曾萬(wàn)勇,李 佳

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.河南南陽(yáng)農(nóng)校園藝系,河南南陽(yáng) 473000)

野生曲莖石斛的離體培養(yǎng)及再生體系研究

余曉麗1,王世茹2,曾萬(wàn)勇1,李 佳1

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.河南南陽(yáng)農(nóng)校園藝系,河南南陽(yáng) 473000)

以野生的曲莖石斛莖段為試材,探討了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)其不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響,并建立了野生曲莖石斛的高效再生體系。結(jié)果表明,利于野生曲莖石斛分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M(B5)+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖;以 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.2mg/L+3.0%蔗糖為增殖培養(yǎng)基時(shí)的增殖效果較佳,增殖倍數(shù)為 5.6;野生曲莖石斛的高效再生體系為MS+KT 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.0 mg/L+2.0%蔗糖,其生根率可達(dá) 94%;移栽基質(zhì)以小樹(shù)皮 +碎火山石 +椰殼粉 (1.2∶1.2∶1)為佳,移栽成活率可達(dá)到 94%。

曲莖石斛;組織培養(yǎng);快速繁殖;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

曲莖石斛 (Dendrobium flexicaule),為蘭科(Orchidaceae)植物石斛屬 (Dendrobium Sw.),是1986年在伏牛山發(fā)現(xiàn)的新種,屬地道藥材,是常用的名貴中藥中藥西楓斗的原植物之一[1-2]。石斛以莖入藥,性寒,味甘,有滋陰助陽(yáng)、補(bǔ)心生血、養(yǎng)肝腎的作用,神話有起死回生之功。因其生長(zhǎng)在懸崖峭壁上,采挖十分困難,采收時(shí)連根拔起,使自然資源日益減少,我國(guó)已將其列為瀕于絕滅的受保護(hù)的中藥品種之一[3-4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)多種石斛植物進(jìn)行了組織研究[5-10],而對(duì)曲莖石斛莖段的組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)利用河南省西峽縣細(xì)莘溝野生的曲莖石斛莖段作試材,建立曲莖石斛的再生體系,為進(jìn)一步的研究提供可靠的基礎(chǔ),并培育出曲莖石斛苗數(shù)千株,生長(zhǎng)良好。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

河南省西峽縣細(xì)莘溝野生的曲莖石斛莖段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的滅菌方法

將嫩莖去掉葉片,用鑷子輕輕將膜質(zhì)葉鞘剝?nèi)?切取帶有芽眼的嫩莖段 (長(zhǎng)約 (1—2 cm)。分別用A、B、C、D四種方法進(jìn)行表面消毒。

A：用 75%的酒精浸泡 10 s,然后用 2%的次氯酸鈉處理 18 min,再用無(wú)菌水沖洗 4—5次。

B：用 75%的酒精浸泡 10 s,然后用 0.1%的升汞處理 10 min,再用無(wú)菌水沖洗 4—5次。

C：用 1.5%的次氯酸鈉處理 20 min,然后用無(wú)菌水沖洗 4—5次,接種到無(wú)糖培養(yǎng)基上培養(yǎng) 10 d后,再用方法 B消毒。

D：用 0.1%的升汞處理 10 min,然后用無(wú)菌水沖洗 4—5次,接種到無(wú)糖培養(yǎng)基上培養(yǎng) 10 d后,再用方法A消毒。

把消毒的曲莖石斛莖段接種到預(yù)先準(zhǔn)備的啟動(dòng)培養(yǎng)基上,一瓶接種一個(gè)莖段,在 23℃±2℃,光照12 h/d,光照強(qiáng)度 15000 Lx的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

A-1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖

A-2：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%蔗糖

A-3：B5+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖

A-4：B5+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%蔗糖

1.2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

B-1：MS+6-BA 2.0 mg/L+ IBA 0.5 mg/L+3.0%蔗糖

B-2：MS+6-BA 2.0 mg/L+ IBA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖

B-3：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%蔗糖

B-4：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖

B-5：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.2 mg/L+3.0%蔗糖

B-6：B5+6-BA 2.0 mg/L+ IBA 0.5 mg/L+3.0%蔗糖

B-7：B5+6-BA 2.0 mg/L+ IBA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖

B-8：B5+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3.0%蔗糖

B-9：B5+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖

B-10：B5+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.2 mg/L+3.0%蔗糖

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

C-1：MS+KT 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L+2.0%蔗糖

C-2：MS+KT 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2.0%蔗糖

C-3：MS+KT 1.5 mg/L+NAA 1.0+mg/LI

BA 1.0 mg/L+2.0%蔗糖1.2.5 移栽基質(zhì)的篩選

D-1：小樹(shù)皮 +碎火山石 +椰殼粉 (1.2∶1.2∶1)

D-2：小樹(shù)皮 +椰殼粉 (1.2∶1)

D-3：小樹(shù)皮 +碎火山石 (1∶1.2)

D-4：碎火山石 +椰殼粉 (1∶1)

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的滅菌

曲莖石斛幼莖經(jīng)四種不同方法滅菌后接種,15 d后觀察結(jié)果如表1所示。

表1 不同滅菌方法對(duì)曲莖石斛莖段存活率的影響

從表1中可以看出,不同的滅菌方法莖段存活率差異較大;方法 C和 D滅菌后莖段存活率分別達(dá)到 31.1%和 26.7%,較為理想,但方法 D使用的滅菌劑是升汞,不宜徹底清洗,對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重,因此方法 C滅菌較為適宜。

2.2 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒后的曲莖石斛幼莖切成 0.5—1.0 cm,分別接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上,激素配比單位為 mg/L,觀察結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)野生曲莖石斛不定芽誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出,曲莖石斛幼莖啟動(dòng)培養(yǎng)基MS、B5基本無(wú)差異,激素配比以 6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L較為適宜。

2.3 增殖培養(yǎng)

將生長(zhǎng)旺盛的試管苗單芽莖段轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上,每瓶 4株,各接 20瓶進(jìn)行培養(yǎng),激素配比單位為 mg/L,觀察結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)野生曲莖石斛不定芽增殖的影響

從表3可以看出：曲莖石斛幼莖繼代培養(yǎng)基MS、B5均無(wú)差異,MS稍好于 B5,激素配比以 6-BA 2.0 mg/L+NAA1.2mg/L較為適宜。B-1和 B-6、B-2和 B-7號(hào)在 6-BA、 IBA濃度相同的條件下,MS、B5培養(yǎng)基增殖均不理想,但基部形成較大的愈傷組織,可以誘導(dǎo)形成原球莖。

2.4 生根培養(yǎng)

將曲莖石斛莖段,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)生根,每瓶接種 4株,各接種 20瓶,激素配比單位為 mg/L,30 d觀察結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)野生黃木香不定芽生根的影響

從表4可以看出,C-1培養(yǎng)基生根率、每株根數(shù)、根長(zhǎng)略高于 C-3培養(yǎng)基,但根較細(xì)弱,苗生長(zhǎng)緩慢,C-3培養(yǎng)基在生根率、每株根數(shù)、根長(zhǎng)、苗生長(zhǎng)速度等方面較為理想,試驗(yàn)表明：曲莖石斛生根培養(yǎng)基以MS+KT 1.5 mg/L+ IBA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L為最佳。

2.5 移栽基質(zhì)

將高 5—8 cm、根系完好的試管苗,洗去培養(yǎng)基,經(jīng)高錳酸鉀消毒后,移栽到 4-1至 4-4基質(zhì)中,每種處理 30株苗,分 6行,移栽 30 d后上盆 ,同時(shí)計(jì)算幼苗成活率。觀察結(jié)果如表5所示。

表5 不同基質(zhì)對(duì)曲莖石斛試管苗移栽成活率的影響

從表5試驗(yàn)結(jié)果可以看出：D-1基質(zhì)移栽成活率可達(dá)到 93%,D-4基質(zhì)最低,只有 30%,可能是曲莖石斛的根系生長(zhǎng)需要較濕潤(rùn)且透氣的環(huán)境,而D-1基質(zhì)：小樹(shù)皮 +碎火山石 +椰殼粉 (1.2∶1.2∶1)的特性及組合滿足了這一需要,既能透氣又能排水保水。

3 結(jié)論與討論

有關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)石斛組織培養(yǎng)特性的研究已有大量報(bào)道。本研究表明,不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比及其他誘導(dǎo)因子對(duì)野生曲莖石斛的組培有很大影響,曲莖石斛起動(dòng)培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基為 M(B5)+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L+3.0%蔗糖;以 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.2 mg/L+3.0%蔗糖作繼代培養(yǎng)基效果最好,增殖倍數(shù)5.6;利于生根的培養(yǎng)基為 MS+KT 1.5 mg/L +IBA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2.0%蔗糖,生根率為 91%;移栽基質(zhì)以小樹(shù)皮 +碎火山石 +椰殼粉 (1.2∶1.2∶1)為佳,移栽成活率可達(dá)到 94%。

野生的曲莖石斛幼莖消毒后存活率較低,污染率較高,合適的消毒方法有待進(jìn)一步試驗(yàn)。初代培養(yǎng)啟動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng),需要進(jìn)一步試驗(yàn)。繼代培養(yǎng)中,基部膨大形成愈傷組織,愈傷組織可形成原球莖,再生出小植株,增大繁殖系數(shù),適宜的培養(yǎng)基及激素配比需要進(jìn)一步試驗(yàn),組培曲莖石斛與野生曲莖石斛的生物堿含量及藥用等方面需要進(jìn)一步研究。

[1] 冉懋雄.石斛〔M〕.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2002.

[2] 《中國(guó)中藥資源從書》編委會(huì).中國(guó)常用中藥材〔M〕.北京：科學(xué)出版社,1995.

[3] 李滿飛,徐國(guó)鈞.商品石斛的調(diào)查及鑒定 (Ⅱ)[J].中草藥 ,1991,22(4)：173.

[4] 陳心啟,吉占和.中國(guó)蘭花全書 [M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社,1998.

[5] 張明,夏鴻西,朱利泉,等.石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2000,25(6)：323-326.

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[7] 葉秀嶙,程式君,王伏雄.黑節(jié)草未成熟種子的形態(tài)發(fā)育及其在離體培養(yǎng)時(shí)的表現(xiàn)[J].云南植物研究,1988,10(30)：285.

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Culturing of wild Dendrobium flexicaule and studing of regeneration system

YU Xiao-li1,Wang Shi-ru2,Zeng Wang-yong1,Li Jia1
(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Horticulture Department of Nang Yang Agriculture School,Nanyang 473000,China)

By taking wild Dendrobium flexicaule as exp l ants,we studied the influence of different growth regulating substances on adventitious buds induction,multiplication and rooting,and established regeneration system of high efficiency on Dendrobium flexicaule.The results suggested that the best medium for induce wasM(B5)+6-BA 2.0 mg/l+NAA 0.8 mg/l+3.0%sucrose;the best medium for the multiplication of medium was the best with MS+6-BA 2.0 mg/l+NAA 1.2 mg/l+3.0%sucrose,the multiplication multiple was 5.6;the regeneration system of high efficiency on Dendrobium flexicaule was MS+KT 1.5 mg/l+NAA 1.0 mg/l+ IBA 1.0 mg/l+2.0%sucrose,and the rooting rate was 94%.The optimum transplantation medium is little brak+volcanic rocks+coconut shell powder(1.5∶1.5∶1)and the survival rate is over 94%.

Dendrobium flexicaule;tissue culture;rapid propagation;plant growth regulator(PGR)

S 567

A

1009-4881(2010)01-0021-04

10.3969/j.issn.1009-4881.2010.01.007

2009-10-11.

余曉麗 (1963-),女,副教授 ,E-mail：yxlL268@126.com.

武漢工業(yè)學(xué)院校立科研項(xiàng)目(07Y03). .