河北省2005年～2007年生肉源單增李斯特菌的血清型及脈沖場凝膠電泳分析*

張耀祺，王彬，師寶忠，閆鶴，石磊

1(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640) 2(保定職業(yè)技術學院，河北保定，071000)3(河北省生物工程技術研究中心，河北保定，071002)

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)簡稱單增李斯特菌，屬于李斯特菌屬(Listeria)，為細胞內寄生的革蘭氏陽性桿菌。單增李斯特菌是重要的人獸共患病病原體，也是食品中常見的，公共衛(wèi)生學上重要的食源性病原體［1］。WHO和FDA于1986年設立了李斯特菌研究中心，專門協(xié)調該菌的病原學、流行病學及臨床等研究工作。該菌已被列為20世紀90年代四大食源性疾病致病菌之一［2］。

單增李斯特菌廣泛分布在自然環(huán)境中，如土壤、污水、飼料、動物、健康人攜帶者及各種生食和即食食品中包括生肉及熟肉制品、速凍米面食品、奶酪、蔬菜、沙拉和海產品等［3］。近十幾年來世界各地，特別是美國、法國、英國、西班牙和日本等發(fā)達國家，因單增李斯特菌污染食品而引起食源性疾病爆發(fā)日益增多，該菌致病性強、致死率高達30%［4－5］。我國到目前為止，雖未出現(xiàn)有關單增李斯特菌引起食物中毒爆發(fā)流行的報道，但從國內多篇調查報道了解，單增李斯特菌多年來在我國豬、羊、雞、牛、兔等家禽家畜中有流行［6－7］，并已經報告的臨床散發(fā)病例有數(shù)十例［8］。目前食品中由單增李斯特菌引起的中毒已引起世界各國的重視。

血清分型法雖已被用于單增李斯特菌的流行病學調查和群體遺傳學研究，但是與分子分型方法相比，重復性差且分辨力不高，一般作為分型的輔助方法［9］。脈沖場凝膠電泳分型(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)具有分型能力強、分辨力高、重復性好、結果易于解釋等優(yōu)點，是目前分子分型方法的黃金標準。20世紀80年代末90年代初，PFGE開始被用于單增李斯特菌的分型研究［10］。單增李斯特菌的血清分型和脈沖場凝膠電泳分型促進了對李斯特菌病暴發(fā)的監(jiān)控和單增李斯特菌污染源的追蹤，該領域的進一步研究為李斯特菌病的有效預防與控制奠定重要基礎。

1 實驗材料

1.1 菌株

53株單增李斯特菌分離自2005年～2007年中國河北省的各種生肉類食品，見表1。

1.2 儀器與試劑

Smart Spec Plus型分光光度計，Bio-Rad公司;CHEF MAPPER型脈沖場凝膠電泳儀及配套設備，Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;單增李斯特菌分型血清，日本デンカ生研株式會社;低熔點瓊脂糖、電泳級瓊脂糖，Bio-Rad公司;溶菌酶、蛋白酶K，Sigma公司;限制性內切酶ApaⅠ，CHIMERx公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)，北京普博欣生物科技有限公司;細胞裂解液(CLB);1×TE緩沖液;0.5×TBE電泳緩沖液。

表1 單增李斯特菌菌株來源

2 方法

2.1 血清分型實驗

參照單增李斯特菌診斷血清使用說明書，O抗原采用玻片凝集法，H抗原采用試管凝集法。

2.2 PFGE 分型實驗

從凍存管中挑細菌接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取2 mL菌液于離心管中，高速離心沉淀細菌，用TE緩沖液洗滌3次。加入適量TE緩沖液重新懸浮細菌，將懸液OD600nm的吸光度調整在1.25 ～1.35之間［11］。取 300 μL 菌液加入工作濃度為20 mg/mL的溶菌酶，混合均勻，37℃溫育30 min。加入等體積SSP消化液(1%SDS，1.2%低熔點瓊脂糖，0.2 mg/mL蛋白酶K，50℃)混勻后倒入模具制備膠塊。將完全凝固的膠栓轉入含有2 mL細胞裂液的離心管中，54℃振搖孵育2 h。用54℃預熱的雙蒸水洗滌膠栓2次，每次浸泡10 min。用54℃預熱的TE緩沖液洗滌膠栓4次，每次浸泡15 min。最后每管加入5 mL pH值8.0的TE緩沖液。然后切膠至1.5 mL PE管中，加入300 μL酶切反應體系(其中含ApaⅠ酶200U)，于37℃酶切反應過夜［12］。消化后的樣品栓置于1.2%的凝膠加樣孔中進行脈沖場電泳。電泳條件:電泳溫度14℃，電壓6 V，脈沖角度120°，脈沖時間4～40 s，電泳時間 22 h［13］。電泳結束后，將凝膠用1 μg/mL的EB溶液染色30 min，在凝膠成像系統(tǒng)讀膠。用Quantity One軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析。

3 結果

3.1 血清分型實驗結果

本研究分別對53株單增李斯特菌進行血清學分型，結果分屬5個血清型。其中 29株為1/2a(54.72%)，11 株為 1/2b(20.75%)，10 株為 1/2c(18.87%)，2 株為 4b(3.77%)，1 株為 4c(1.89%)1/2a，1/2b和1/2c屬于主要血清型。各菌株對應的血清型詳見圖1。

3.2 PFGE圖譜聚類分析結果

本研究對53株單增李斯特菌進行了PFGE分型，基因組DNA用ApaⅠ酶切后，經電泳DNA片段得到良好的分離，53株均產生清晰的條帶，各株細菌DNA條帶數(shù)目為10～13條。所有單增李斯特菌菌株的PFGE圖譜結果用Quantity One軟件進行分析，其相似值在52% ～100%。PFGE圖譜詳見圖1。

Tenover等［14］提出了有關菌株同源性的判別標準，按其電泳條帶可分為:無差異，說明為相同菌株;有1～3條帶的差異說明菌株間有相近關系，且只有單基因的改變;4～6條帶的差異說明菌株間可能有相近關系，表示出有2個獨立基因的差異;如菌株間有6條帶或更多條帶差異，說明有3個或更多基因的變化，被視為無相關性。根據(jù)實驗結果可把53株單增李斯特菌分成17個基因型(A-Q)。主要型別為Q型(12株)，占總數(shù)的22.64%(12/53)，提示該型為河北省生肉類食品主要基因型。其余依次降低的型別為P型15.09%(8/53)，L型13.21%(7/53)，J型11.32%(6/53)。基因分型結果詳見圖1。

4 討論

血清分型是一種傳統(tǒng)的細菌分型方法。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原，可將單增李斯特菌分為16個血清型:1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b 和 7。抗原結構與毒力無關，對人致病的主要為血清型為4b，其次是1/2a和1/2b，3者約占本病的90%［15］，其中大多數(shù)經由食物污染引起的李斯特菌病屬于4b血清型［16］。本次從食品中分離得到的53株單增李斯特菌的血清型主要為1/2a(54.72%)，1/2b(20.75%)和 1/2c(18.87%)，4b血清型卻相對較少，這與國內外的相關報道一致［17－18］。這幾種血清型均有較強的致病性，能引起嚴重的李斯特菌食源性疾病，危害身體健康。因此，應加強相關食品中單增李斯特菌的監(jiān)測力度，重點防治由上述幾種血清型菌株引起的食物中毒。

圖1 LM菌株的PFGE聚類樹狀圖

PFGE如今已經廣泛用于單增李斯特菌的分子流行病學和溯源性追蹤研究，并被認為是目前所有分型方法中最為可靠的一種。從本次研究菌株的PFGE聚類分析圖譜來看，53株單增李斯特菌分成17個基因型(A-Q)，其中Q型為河北省流行的主要基因型，占總數(shù)22.64%。17個基因型之間出現(xiàn)了4條以上的差異條帶，說明這些菌株的基因型不緊密相關。雖然有一部分菌株之間遺傳學表現(xiàn)形式相同，但是大部分菌株在遺傳學上有不同的表現(xiàn)形式，即菌株之間的相關性不大，證明各類食品中的單增李斯特菌的污染是來自多方面的，多個克隆株的。

綜合血清分型和PFGE分型結果進行分析，在4種主要的PFGE基因型中，Q型(22.64%)包括了血清型1/2a和1/2c;P型(15.09%)包括血清型1/2a、4c;L型(13.21%)和J型(11.32%)都只含血清型1/2a。對人致病的最主要血清型4b有兩株，都分布于H基因型(見圖1)。血清型和PFGE 2種分型方法各具特色，相互不能替代，兩者從不同側面反映單增李斯特菌的分型特點。結合兩種分型方法能更好地了解單增李斯特菌各菌株之間的遺傳相關性及流行病學特征，促進了對李斯特菌病暴發(fā)的監(jiān)控和單增李斯特菌污染源的追蹤。

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