基于DNA染料EMA的PCR技術(shù)檢測(cè)鑒別副溶血性弧菌死活細(xì)胞*

祝儒剛，呂淑霞，劉月萍，張喆

1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)2(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)3(遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110036)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是海洋和鹽湖中分布的一種嗜鹽性病原菌。分布在近海岸的海水、海底沉積物、魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)中，適應(yīng)于高濃度(6%)食鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)。該菌是亞于霍亂弧菌的一種常見(jiàn)腸道致病菌，其污染會(huì)給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，還會(huì)引起人類(lèi)腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現(xiàn)腹瀉、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭痛等癥狀。自2001年以來(lái)，副溶血弧菌性食物中毒爆發(fā)已經(jīng)成為中國(guó)最常見(jiàn)的食源性疾患［1－4］。

隨著人們對(duì)食品安全性要求的不斷提高，PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血弧菌的最主要手段［5－6］。然而，此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分所檢測(cè)到的副溶血弧菌是活細(xì)胞還是死細(xì)胞。近年來(lái)，人們嘗試各種方法通過(guò)PCR技術(shù)僅僅檢測(cè)樣品中的活菌，例如mRNA的檢測(cè)，以及利用能夠與核酸共價(jià)結(jié)合的染料，這種染料能夠選擇性地滲透到死細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞內(nèi)的DNA共價(jià)結(jié)合。在所有這些方法中，一種DNA插入型染料EMA(ethidium bromide monoazide)，展現(xiàn)出了很大的應(yīng)用潛力，能夠克服所面臨的困難。許多研究表明，EMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠成功地選擇性抑制樣品中死細(xì)胞的DNA擴(kuò)增，以便于更加精確地檢測(cè)樣品中活菌細(xì)胞的存在［7－10］。

EMA是一種熒光插入型的核酸結(jié)合染料，這種染料最顯著的特點(diǎn)是當(dāng)樣品中死活細(xì)胞共同存在時(shí)，它能夠選擇性地與死細(xì)胞DNA共價(jià)結(jié)合。由于活菌細(xì)胞的細(xì)胞膜比較完整，EMA不能滲透到活菌細(xì)胞內(nèi)部。然而，由于通常死細(xì)胞的細(xì)胞膜已經(jīng)遭到破壞，EMA很容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部從而插入到細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上。在經(jīng)過(guò)高強(qiáng)度的可見(jiàn)光曝光處理后，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發(fā)生共價(jià)交叉偶合作用，從而導(dǎo)致死細(xì)胞內(nèi)部的DNA在接下來(lái)的PCR擴(kuò)增過(guò)程中被抑制［11－12］。

本研究將EMA選擇滲透性和PCR特異性和靈敏性相結(jié)合，從而建立一種快速、靈敏并能夠有效檢測(cè)和定量純培養(yǎng)條件下副溶血弧菌死活細(xì)胞混合液中的活細(xì)胞的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株，副溶血弧菌ATCC17802，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀(TC-512)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(752N)，鹵鎢燈(500W)，BIO-RAD凝膠成像儀。

1.3 試劑及培養(yǎng)基

EMA(ethidium bromide monoazide，美國(guó) Sigma公司)，胰胨肉湯(蛋白胨2%，NaCl 4%，0.01%的結(jié)晶紫0.5%，pH值9.0)。

1.4 副溶血弧菌熱致死時(shí)間確定

取37℃、150 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液10 mL，10 000r/min離心10 min。菌體沉淀懸浮于10 mL 0.85%的生理鹽水中，10 000 r/min離心10 min。菌體沉淀再懸浮在10 mL 0.85%的生理鹽水中，再次 10 000 r/min離心 10 min。測(cè)定OD600nm并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

取0.5 mL上述菌懸液調(diào)整其濃度為2×108CFU/mL至1.5 mL離心管中，95℃水浴加熱，每隔30 s取樣涂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.5 最佳曝光時(shí)間確定

用ddH2O配制0.1 mg/mL的EMA溶液，－20℃避光保存(EMA為致癌物質(zhì)，注意操作安全)。分別取0.5 mL熱致死副溶血弧菌菌懸液(2×108CFU/mL)于7個(gè)小離心管，加入EMA使每管EMA終濃度達(dá)到1.4 μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置5 min。然后將離心管開(kāi)蓋放置冰上，距離燈管16 cm，分別曝光 0、1、3、5、10、15 和 20 min。同樣方法取活菌菌懸液作為對(duì)照。

1.6 不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度確定

取EMA溶液(1 mg/mL)分別加入裝有0.5 mL活細(xì)胞的副溶血弧菌菌懸液(2×108CFU/mL)的7支離心管中，使 EMA終濃度分別達(dá)到0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL 和 12 μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5 min。然后將離心管開(kāi)蓋放置冰上，距離燈管16 cm，曝光20 min。

1.7 完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小EMA濃度確定

將EMA(0.1 mg/mL)分別加入裝有0.5 mL熱致死副溶血弧菌菌懸液(2×108CFU/mL)的9支離心管中，使 EMA 終濃度分別達(dá)到 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和 1.6 μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5 min。然后將離心管開(kāi)蓋放置冰上，距離燈管16 cm，曝光20 min。

1.8 死活細(xì)胞混合菌懸液的EMA-PCR擴(kuò)增

在完全一樣的8只離心管中分別加入0.25 mL固定數(shù)量(5×107CFU)的熱致死細(xì)胞菌懸液與0.25 mL 變化數(shù)量(5 ×107、5 ×106、5 ×105、2.5 ×105、5 ×104、2.5×104、5×103和 2.5 ×103CFU)的活細(xì)胞菌懸液(生理鹽水漂洗)，混合均勻。向菌懸液中加入0.1 mg/mL的EMA，使EMA終濃度達(dá)到1.4 μg/mL。將菌懸液在黑暗中室溫放置5 min，然后將離心管開(kāi)蓋放置冰上，距離燈管16 cm曝光20 min。曝光后的混合菌懸液在10 000 r/min離心5 min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5 mL的生理鹽水中，10 000 r/min再次離心5 min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸在0.5 mL生理鹽水中，提取模板DNA。

1.9 DNA 模板制備［13－14］

用TZ裂解液(2.0%Triton X－100，2.5 mg/mL的疊氮化鈉，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0)提取模板DNA。

0.5 mL的各種菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴10 min后冷卻到室溫，8 000 r/min離心5 min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作PCR模板。

1.1 0 引物及PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的副溶血弧菌tlh基因(基因序列號(hào)AY578148)序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，上游引物(P1)為:5＇-AAG CGG ATT ATG CAG AAG CA-3＇，下游引物(P2)為:5＇-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為449bp。優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件為:25 μL的PCR反應(yīng)體系中含 4 μL 模板，2.5 μL 的 10 × PCR Buffer，各10pmol的引物，2 μL 的 25 mmol/L MgCl2，2 μL 的2.5 mmol/L dNTP，0.2 μL 的 Taq酶，用滅菌水補(bǔ)足到25 μL體系。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，29個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 2 min，最后 72℃延伸 10 min［15－18］。

1.1 1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及定量分析

取10 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(100 V，1 h)，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。利用NIH1.61圖像分析軟件定量分析混合液中各DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度，相對(duì)熒光強(qiáng)度取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌熱致死時(shí)間

將原始菌懸液做梯度稀釋?zhuān)瑴y(cè)定各梯度的OD600nm值，取其中一個(gè)梯度懸液涂平板，設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)算每個(gè)梯度的菌濃度。得到活菌的菌濃度隨OD600nm變化曲線，如圖1所示。由圖1可知，當(dāng) OD600nm為0.42時(shí)，菌濃度正好為2×108CFU/mL。

圖1 菌濃度與OD600nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線

95℃水浴處理副溶血弧菌菌懸液(OD600nm為0.42，2×108CFU/mL)，每隔 30s取樣涂平板，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察計(jì)數(shù)(表2)。結(jié)果表明，隨著熱處理時(shí)間的增加，其平板菌落數(shù)逐漸減少，當(dāng)熱處理時(shí)間延長(zhǎng)到9 min時(shí)，副溶血弧菌已失活，平板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，平板計(jì)數(shù)為0。因此，為了確保所有副溶血弧菌完全被殺死，得到結(jié)果:將濃度為2×108CFU/mL的副溶血弧菌菌懸液在95℃水浴處理10 min，所有副溶血弧菌細(xì)胞都已經(jīng)殺死，平板計(jì)數(shù)為0。

表1 不同加熱時(shí)間處理的活細(xì)胞數(shù)

2.2 最佳曝光時(shí)間

熱致死細(xì)胞和活細(xì)胞菌懸液(2×108CFU/mL)分別經(jīng)EMA(終濃度1.4 μg/mL)處理后，曝光1～20 min，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 EMA處理熱致死細(xì)胞的最佳曝光時(shí)間優(yōu)化(A):條帶1～7分別為EMA濃度為1.4μg/mL時(shí)熱致死細(xì)胞曝光 0、1、3、5、10、15 和 20 min 后的 PCR 凝膠電泳圖。條帶8為陰性對(duì)照(不加模板DNA)。M為DNA Marker。(A'):為(A)凝膠電泳圖上相應(yīng)DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

圖3 EMA處理活細(xì)胞的最佳曝光時(shí)間優(yōu)化(B):條帶1～7分別為EMA濃度為1.4μg/mL時(shí)活細(xì)胞曝光0、1、3、5、10、15和 20 分鐘后的 PCR 凝膠電泳圖。條帶8為陰性對(duì)照(不加模板DNA)。M為DNA Marker。(B＇):為(B)凝膠電泳圖上相應(yīng)DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)EMA(終濃度1.4 μg/mL)處理后死細(xì)胞的PCR擴(kuò)增條帶逐漸變?nèi)酰?dāng)曝光時(shí)間延長(zhǎng)到15 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光條帶變得很淡，曝光時(shí)間延長(zhǎng)到20 min時(shí)熒光條帶完全消失(P＜0.01)。而對(duì)照組活菌細(xì)胞則隨著曝光時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光條帶沒(méi)有明顯變化。因此，在整個(gè)試驗(yàn)中都以20 min為最佳EMA曝光時(shí)間。

2.3 不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度

EMA的不同添加量對(duì)活菌PCR擴(kuò)增的抑制作用電泳圖譜如圖4。隨著EMA濃度的逐漸增加，PCR擴(kuò)增條帶也逐漸變?nèi)酰砻鱁MA濃度足夠大時(shí)對(duì)活菌的PCR擴(kuò)增也有一定抑制作用。圖譜分析可知，當(dāng)EMA濃度小于等于2 μg/mL時(shí)，EMA對(duì)活細(xì)胞PCR擴(kuò)增沒(méi)有明顯抑制作用(P＞0.01)。然而，當(dāng)EMA的添加量增加到4 μg/mL時(shí)，EMA對(duì)活細(xì)胞的PCR擴(kuò)增有顯著的抑制作用(P＜0.01)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度為 2 μg/mL。

圖4 不抑制活菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大EMA濃度優(yōu)化(A):不同EMA濃度下活菌細(xì)胞EMA-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為DNA Marker。條帶1～7所對(duì)應(yīng)EMA 濃度分別為 0、2、4、6、8、10 和 12 μg/mL。第 8 泳道為陰性對(duì)照(不加模板DNA)。(A＇):為(A)凝膠電泳圖上相應(yīng)DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2.4 完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小EMA濃度

隨著EMA濃度的不斷增加，PCR擴(kuò)增條帶的亮度越來(lái)越弱，當(dāng)EMA的終濃度等于或者大于1.2 μg/mL時(shí)，電泳圖譜上沒(méi)有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，即熱致死細(xì)胞的PCR擴(kuò)增被完全抑制(P＜0.01)(圖5)。此時(shí)，1.2 μg/mL的EMA濃度小于可以抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的EMA濃度2 μg/mL，因此，為了能夠使死細(xì)胞的PCR徹底被EMA抑制，同時(shí)又不會(huì)抑制活細(xì)胞的PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)中選擇EMA濃度1.4 μg/mL為完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增時(shí)EMA的最適濃度。此時(shí)，通過(guò)EMA-PCR完全能夠區(qū)分海產(chǎn)品中副溶血弧菌死活細(xì)胞。

圖5 完全抑制死菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA添加量的優(yōu)化(A):不同EMA濃度下死菌細(xì)胞EMA-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為DNA Marker。條帶1～9所對(duì)應(yīng)的EMA 濃度分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6μg/mL。第10泳道為陰性對(duì)照(不加模板 DNA)。(A＇):為(A)凝膠電泳圖上相應(yīng)DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2.5 相對(duì)熒光強(qiáng)度與副溶血弧菌死活細(xì)胞混合液中活細(xì)胞對(duì)數(shù)的線性關(guān)系

定量的死菌細(xì)胞與變化量的活菌細(xì)胞的混合液中，死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增被EMA(1.4 μg/mL)完全抑制，DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度隨著活細(xì)胞數(shù)(2×105、2 × 104、2 × 103、1 × 103、2 × 102、1 × 102、2 ×101、和1×101CFU/PCR)的減少而逐漸減弱(圖6A)，檢測(cè)限能達(dá)到10CFU/PCR。而且，由圖6A＇可知，在1×101到2×105CFU/PCR體系范圍內(nèi)，DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度與每個(gè)PCR反應(yīng)體系中所存在的活細(xì)胞菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)可以相對(duì)熒光強(qiáng)度來(lái)對(duì)每個(gè)PCR體系中的活菌數(shù)進(jìn)行定量。

3 結(jié)論

圖6 DNA條帶相對(duì)熒光強(qiáng)度與死活細(xì)胞混合液中活細(xì)胞對(duì)數(shù)值的關(guān)系(A):變化數(shù)量的活細(xì)胞(5×107、5 ×106、5 ×105、2.5 ×105、5×104、2.5 ×104、5 ×103和 2.5 ×103CFU)與固定數(shù)量(5×107CFU)死活細(xì)胞混合液的EMA-PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，EMA終濃度均為1.4 μg/mL。1～8泳道中，每個(gè)PCR體系活細(xì)胞數(shù)分別為2×105、2×104、2 × 103、1 × 103、2 × 102、1 × 102、2 × 101、和 1 ×101CFU;第9泳道為陰性對(duì)照(不加模板DNA)。M為DNA marker。(A＇):相對(duì)熒光強(qiáng)度與死活細(xì)胞混合液中活細(xì)胞對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系。

本文將DNA染料EMA與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相結(jié)合，研究了純培養(yǎng)副溶血弧菌死活細(xì)胞的鑒別方法。研究結(jié)果表明，副溶血弧菌中激活和光解EMA的最佳曝光時(shí)間為20 min，與類(lèi)志賀鄰單胞菌(Weimin Gu and Robert E.Levin，2008)、創(chuàng)傷弧菌(Wang and levin，2006)、埃希氏大腸桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌以及沙門(mén)氏菌(Nogva et al，2003)的最佳曝光時(shí)間基本相同。不抑制副溶血弧菌活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度是2 μg/mL，比類(lèi)志賀鄰單胞菌的5 μg/mL(Weimin Gu and Robert E.Levin，2008)以及創(chuàng)傷弧菌的3 μg/mL(Wang and levin，2006)都要低。完全抑制副溶血弧菌死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小EMA濃度為1.4 μg/mL，比類(lèi)志賀鄰單胞菌的0.75 μg/mL(Weimin Gu and Robert E.Levin，2008)要高，但是比創(chuàng)傷弧菌的2.5 μg/mL(Wang and levin，2006)要低，比大腸桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌以及沙門(mén)氏菌(Nogva et al，2003)的10 μg/mL顯著偏低。通過(guò)這些數(shù)據(jù)比較表明，當(dāng)用EMA-PCR方法區(qū)別不同種類(lèi)微生物死活細(xì)胞的時(shí)候，完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最適EMA濃度以及能夠影響活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大EMA濃度都需要重新優(yōu)化［7－11］。

經(jīng)EMA(1.4 μg/mL)處理定量的死菌細(xì)胞與變化量的活菌細(xì)胞的混合液，死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增被完全抑制，在1×101～2×105CFU/PCR范圍內(nèi)，活細(xì)胞DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度與每個(gè)PCR反應(yīng)體系中所存在的活細(xì)胞菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)線性關(guān)系，此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來(lái)定量任何來(lái)源的樣品中的細(xì)菌數(shù)。

在本實(shí)驗(yàn)中，副溶血弧菌細(xì)胞熱致死的條件是95℃水浴加熱10 min。而Weimin Gu and Robert E.Levin(2008)的類(lèi)志賀鄰單胞菌的熱致死條件是72℃水浴10 min，Wang and Levin(2006)創(chuàng)傷弧菌的熱致死條件是 100℃條件下5 min，在 Nogva et al(2003)的研究中，埃希氏大腸桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌以及沙門(mén)氏菌被殺死在72℃或者100℃加熱5 min，或者使用其他致死介質(zhì)(96%的酒精，70%的異丙醇，或者0.1‰的殺藻胺)?？梢?jiàn)，不同的活菌細(xì)胞致死方法也可能會(huì)影響到所需要的EMA的濃度［7］。

EMA-PCR是最近新出現(xiàn)的一種有效地區(qū)別微生物死活細(xì)胞的方法，利用EMA-PCR能夠有效地檢測(cè)并快速定量副溶血弧菌死活細(xì)胞混合液中的活細(xì)胞，從而對(duì)人類(lèi)食品安全檢測(cè)發(fā)揮重要的作用。

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