胃病患者胃黏膜真菌感染的檢測(cè)

鄭劍玲,王垂杰,齊 賀,傅紀(jì)婷,李玉峰,段 薇

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫微生物室,遼寧沈陽 110101;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院消化科,遼寧沈陽 110032)

胃潰瘍是臨床常見的多發(fā)性消化系統(tǒng)疾病,也是胃癌的癌前病變,嚴(yán)重影響患者的消化功能和生活質(zhì)量,對(duì)胃潰瘍的預(yù)防學(xué)研究具有重要意義。除了目前普遍認(rèn)為幽門螺桿菌感染與胃潰瘍、胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)化有密切關(guān)系[1]之外,也有胃潰瘍、胃癌合并真菌感染的報(bào)道[2-3],但目前尚未見到關(guān)于寄居于胃黏膜的真菌的基因多態(tài)性與潰瘍病損程度關(guān)系的研究報(bào)道。核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer region,ITS)的ITS1-ITS2部分進(jìn)化較快,具有種間特異性和種內(nèi)保守性,是用于真菌種類鑒定和進(jìn)化方式的重要遺傳信息研究的工具[4]。本研究通過檢測(cè)胃炎和胃潰瘍、胃癌患者胃黏膜寄居的真菌ITS序列基因多態(tài)性,了解胃黏膜真菌的菌種多樣性及其與胃潰瘍的關(guān)系,為胃潰瘍預(yù)防學(xué)研究奠定微生物學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 采集2008年7月至8月間消化科就診患者的胃鏡鉗取胃黏膜標(biāo)本63例(所有研究對(duì)象均知情同意,自愿參加本項(xiàng)研究),近3個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑,無腫瘤、糖尿病等導(dǎo)致免疫低下的系統(tǒng)性疾病。

1.1.2 試劑 CHROM agar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基(鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司);酵母樣真菌生化鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司);lyticase(Sigma,US);protease K(Merk,Ger many);Tris、EDTA、SDS(Sigma,US);dNTP(Roche,Switzerland);TaqE(TaKaRa,大連寶生物工程有限公司);genefinder核酸染料(Bio-V,廈門百維信生物科技有限公司);DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000 Marker(大連寶生物工程有限公司);真菌ITS序列通用引物[5](上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.1.3 儀器 Olympus DP 71圖像采集系統(tǒng)(Tokyo,Japan); Image Pro Plus 4.5 sof tware(Media Cybernetics Inc.,Silver Spring,MD,USA);DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠);藍(lán)盾TM551可見光凝膠電泳-透射儀(Bio-V,廈門百維信生物科技有限公司);80-1離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集 樣本來自2008年7月7日至8月25日于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)消化科胃鏡檢查的患者,經(jīng)知情同意,自愿參加本項(xiàng)研究,共63人。男性41名,女性22名,年齡3～81歲,平均年齡38.78歲。用胃鏡鉗取胃竇部黏膜組織樣本,約3 mm×2 mm×1 mm大小,置于無菌Ep管中,-20℃保存。同時(shí)記錄受檢者年齡、性別、學(xué)歷、吸煙、飲酒習(xí)慣、胃鏡檢查所見、病理診斷、病史、用藥治療情況。

1.2.2 真菌分離培養(yǎng) 胃黏膜樣本加入20μL生理鹽水稀釋,吹打混勻。取20μL樣本液,接種于CHROM agar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)3 d,依據(jù)分離培養(yǎng)菌落顏色進(jìn)行鑒定(白假絲酵母菌呈綠色,熱帶假絲酵母菌呈藍(lán)色,光滑假絲酵母菌呈紫色,克柔假絲酵母菌呈粉色,其余假絲酵母菌呈白色)。

1.2.3 真菌菌種形態(tài)學(xué)鑒定 采用微量培養(yǎng)法:將分離培養(yǎng)得到的菌株接種于玉米吐溫80培養(yǎng)基[6],37℃培養(yǎng)24 h。加入亞甲基藍(lán)染色,加熱融化瓊脂,蓋上蓋玻片,光學(xué)顯微鏡下觀察,并攝像記錄其孢子形態(tài)。

1.2.4 真菌菌株的ITS序列檢測(cè)菌種多樣性①真菌DNA提取:取分離培養(yǎng)的白假絲酵母菌5 μL,置1 mL液體沙保羅培養(yǎng)基中增菌。菌液加入3 mg/mL的溶細(xì)胞酶(以山梨醇溶液配制)5 μL,37℃水浴過夜,去細(xì)胞壁。常規(guī)酚-氯仿法提取DNA;②PCR擴(kuò)增:用真菌ITS序列通用引物ITS1:TCCGTAGGTG AACCT GCGG;ITS4:TCCTC CGCTTATTGA TATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(50μL):H2O 41μL,10×buffer 5.0μL,10 mmol/L dNTP 1μL,20μmol/L前引物0.5μL,20 μmol/L后引物0.5μL,5 U/μL TaqE 0.25μL,DNA模板2μL。循環(huán)條件:95℃熱啟動(dòng)5 min;95℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán);72℃10 min;4℃保存。2%瓊脂糖1×TAE緩沖液,genefinder核酸染料染色,110 V 30 min電泳。PCR產(chǎn)物500～900 bp,紫外線凝膠掃描成像,并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果;③ITS序列限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(Restriction fragment length polymorphism,RFLP):RFLP真菌菌種鑒定方法參見文獻(xiàn)[2]。取20μL PCR產(chǎn)物,加入10 U Msp I液,操作參照說明書。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行pearsonχ2檢驗(yàn),ANOVA方差分析,Kendall等級(jí)相關(guān)分析,對(duì)ITS序列酶切結(jié)果、病理診斷、年齡、性別、學(xué)歷、吸煙、飲酒習(xí)慣等各觀察指標(biāo)進(jìn)行比較分析。P<0.05為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃黏膜真菌分離培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)樣本(32/63,50.8%)檢出真菌陽性。CHROM agar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果,31個(gè)樣本呈綠色為白假絲酵母菌,1個(gè)樣本呈紫色為光滑假絲酵母菌。CHROM agar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 CHROM agar假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果Fig.1 CHROM agarCandidaculture medium results

2.2 玉米吐溫80培養(yǎng)基厚壁孢子法菌種鑒定結(jié)果

31個(gè)白假絲酵母菌菌株樣本產(chǎn)生較大圓形厚壁孢子,部分有明顯假菌絲。1個(gè)光滑假絲酵母菌呈較小類圓形孢子,無菌絲。形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果,亞甲基藍(lán)染色(40×)Fig.2 Microscope morphological examination results,methylene blue staining(40×)

2.3 ITS序列RFLP檢測(cè)結(jié)果

32個(gè)真菌菌株樣本均可擴(kuò)增出ITS1-2基因序列,31個(gè)白假絲酵母菌菌株樣本PCR產(chǎn)物約為535 bp,1個(gè)光滑假絲酵母菌株樣本PCR產(chǎn)物約為871 bp。用限制性內(nèi)切酶Msp I酶切后,31個(gè)白假絲酵母菌菌株樣本酶切產(chǎn)物為297 bp和238 bp的2個(gè)條帶,1個(gè)光滑假絲酵母菌菌株樣本酶切產(chǎn)物為557 bp和314 bp的2個(gè)條帶。ITS序列PCR結(jié)果及Msp I酶切后結(jié)果見圖3。

圖3 ITS序列RFLP檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis figures for ITS sequences

2.4 ITS序列分析

淺表性胃炎、萎縮性胃炎、膽汁反流性胃炎,共抽取7個(gè)樣本進(jìn)行ITS測(cè)序。糜爛性胃炎抽取7個(gè)樣本,胃潰瘍抽取7個(gè)樣本進(jìn)行ITS測(cè)序。抽取胃癌1個(gè)樣本進(jìn)行ITS測(cè)序。ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4。

2.5 真菌檢出陽性與病理診斷及流行病因素相關(guān)性分析

經(jīng)Kendall等級(jí)相關(guān)分析,真菌陽性與病理診斷成正相關(guān)(r=0.263,P=0.027),與性別、年齡、吸煙、飲酒、學(xué)歷的相關(guān)性,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在淺表性和萎縮性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、胃癌樣本中真菌陽性率狀況見表1。

表1 在淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、胃癌樣本中真菌檢出陽性率狀況Table 1 Positive rate of fungi from samples of patientswith superficial gastritis,erosive gastritis,gastric ulcer,gastric cancer

圖4 22個(gè)真菌菌株測(cè)序樣本ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequence from 22 fungal strains

3 討 論

胃腸道內(nèi)正常微生物菌群與宿主建立了一種相互依存、相互制約的微生態(tài)關(guān)系,有誘因時(shí)會(huì)出現(xiàn)定植在胃腸道的潛在病原菌感染。胃內(nèi)各種疾病的真菌感染率報(bào)道不一,以胃潰瘍并發(fā)真菌感染多見,其發(fā)病率一般為9.1%～33%[7]。陶文洲報(bào)道胃癌合并胃真菌感染者達(dá)50%[3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)63名胃炎、胃潰瘍和胃癌患者胃黏膜標(biāo)本經(jīng)分離培養(yǎng)真菌,結(jié)果顯示陽性率為50.8%。

Zwolinska等學(xué)者于2006年檢測(cè)了293個(gè)消化不良和胃潰瘍患者的胃黏膜活檢樣本,他們用API系統(tǒng)檢測(cè)從胃潰瘍樣本分離培養(yǎng)出真菌菌種,光滑假絲酵母菌占42.4%,白假絲酵母菌占38.7%[2]。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)出的胃炎和胃潰瘍患者的胃黏膜真菌樣本絕大多數(shù)為白假絲酵母菌,與現(xiàn)有的報(bào)道不盡相同,本實(shí)驗(yàn)鑒定真菌菌種采用的是ITS序列檢測(cè)方法,所以白假絲酵母菌檢出率差異可能與樣本選取和檢測(cè)方法有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)選取ITS序列作為對(duì)白假絲酵母菌多樣性檢測(cè)方法,因真核細(xì)胞核糖體rRNA基因編碼DNA序列為18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA的串聯(lián)重復(fù),其中ITS1和ITS2為內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),ITS1-ITS2部分受自然選擇壓力小,進(jìn)化速度較快,從中可以獲得較多的進(jìn)化信息。同時(shí),5S rRNA-5.8S rRNA rRNA-28S rRNA高度保守,具有種間特異性和種內(nèi)保守性。對(duì)真菌的ITS序列進(jìn)行分析,可以獲得真菌種類鑒定和進(jìn)化方式的可靠遺傳信息,將ITS序列提交GenBank,與全球各地提交的真菌ITS進(jìn)行序列比對(duì),從而了解相關(guān)真菌菌種和菌株的同源性關(guān)系、進(jìn)化方向和分布情況,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真菌的分類進(jìn)化方面的研究[8]。

在人體內(nèi)寄居的真菌主要是假絲酵母菌屬,其中以白假絲酵母菌最為常見。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)真菌32(32/63,50.8%)株,經(jīng)ITS序列測(cè)序鑒定檢測(cè)到的真菌以白假絲酵母菌為主,白假絲酵母菌31株,光滑假絲酵母菌1株。白假絲酵母菌是重要的條件致病性真菌,在機(jī)體免疫功能低下、消化道黏膜生物屏障功能受損時(shí)轉(zhuǎn)化為致病菌,其致病性與菌體的黏附、芽管生成、疏水性和胞外酶等有關(guān)[9]。白假絲酵母菌有菌絲相和酵母相兩種生存形式,菌絲相更易黏附和入侵宿主組織,是該菌在體內(nèi)的主要致病形式[10-13],但這是假菌絲。伴有白假絲酵母菌感染的消化道黏膜增生病變,將出現(xiàn)癌變比例的增高。有研究顯示,白假絲酵母菌胃癌株的毒力及侵襲能力均較正常人口腔菌株強(qiáng)大[14],表明胃病患者與正常人體內(nèi)白假絲酵母菌存在差異。從基因水平上判斷何種差異是最精確的,需對(duì)胃病患者與正常人體內(nèi)白假絲酵母菌真菌菌株測(cè)序分析,構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在淺表性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍、胃癌樣本中真菌檢出陽性率呈現(xiàn)出隨著病情的加重而逐漸上升的趨勢(shì)。為此本實(shí)驗(yàn)選取22個(gè)樣本的真菌菌株測(cè)序分析,構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示真菌基因序列的差異與所致病理損害存在相關(guān)性。病理損害程度相近似的樣本,其菌株基因型之間同源性較高。因?yàn)槭芟抻诨驕y(cè)序樣本例數(shù),僅對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行初步探討,尚不能得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論,進(jìn)一步明確其相關(guān)性有待更深入實(shí)驗(yàn)研究。

從慢性胃炎到最終發(fā)展為胃癌的演變過程中,各種致病因子可能單獨(dú)或協(xié)同作用于不同的階段,微生物感染是其中一個(gè)很重要的因素。目前已普遍認(rèn)為幽門螺桿菌感染是引起胃潰瘍的病因,而同樣可以在胃腸道黏膜寄居的真菌在胃癌、胃潰瘍的發(fā)生、發(fā)展上可能起一定作用,在這一過程中微生物菌群間的相互作用值得重視,它們之間的關(guān)系如何仍有待進(jìn)一步的探討研究。

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