應(yīng)用生物反應(yīng)器建立人用凍干狂犬病疫苗(Vero細(xì)胞)生產(chǎn)工藝的研究

李志強(qiáng),袁延寶,鄭淑媛,代長(zhǎng)海,張夫坤,顧丹陽,戚鳳春

(長(zhǎng)春生物制品研究所,吉林長(zhǎng)春 130062)

狂犬病是一種人獸共患疾病,由于狂犬病在發(fā)病以后無藥可治,因此死亡率達(dá)到100%,對(duì)于被狂犬咬傷的人群,最有效的方法是接種狂犬疫苗,我國每年大約有1 000萬～1 200萬人接受狂犬病毒暴露后的疫苗接種[1]。由于近年來國內(nèi)狂犬病的發(fā)生率有所升高,因此國家藥監(jiān)部門對(duì)狂犬疫苗的質(zhì)量要求越來越高。人用狂犬病疫苗的生產(chǎn),病毒收獲液的毒力滴度是影響疫苗效價(jià)的一個(gè)關(guān)鍵因素,由于采用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)所收獲的病毒原液毒力較低,經(jīng)純化后很難生產(chǎn)出合格的狂犬病疫苗,而通過生物反應(yīng)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高密度的培養(yǎng),可以制備出高毒力的病毒收獲液,從而提高狂犬病疫苗的效價(jià)。本試驗(yàn)以生物反應(yīng)器加入片狀載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng),制備出高毒力滴度的病毒收獲液,經(jīng)純化后生產(chǎn)出合格的凍干人用狂犬病疫苗,疫苗經(jīng)檢定后各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)程要求。此工藝適于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒種 ①Vero細(xì)胞,由本所疫苗一室提供;②aG株;由本課題組從狂犬病毒豚鼠腦毒種經(jīng)Vero細(xì)胞適應(yīng)后獲得。毒種毒力為8.0 lgLD50/mL。

1.1.2 儀器設(shè)備 ①生物反應(yīng)器:New Brunswick Scientifc.CO. INC,USA生產(chǎn),容積15 L,工作容積11.25 L,以壓縮空氣、O2、N2、CO2調(diào)控DO和pH。使用前DO及pH傳感器標(biāo)化準(zhǔn)確[2-4];②超濾器:Milliber公司生產(chǎn),膜包分子量為10萬;③層析柱:采用Sepharose4FF柱色譜法純化,Sepharose4FF由GE Healthcare生產(chǎn)[5];④凍干機(jī):國產(chǎn)小型凍干機(jī)。

1.1.3 試劑與載體 ①細(xì)胞培養(yǎng)液:199/EBSS美國?？寺?shí)驗(yàn)室公司生產(chǎn),補(bǔ)加10%(細(xì)胞生長(zhǎng)期)、1%(細(xì)胞維持期)的小牛血清;②小牛血清:400 mL/瓶、武漢三利生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);③片狀載體:由Jiffy Packaging Company生產(chǎn),加入量為50 g/L。

1.2 方法[6-7]

1.2.1 培養(yǎng)條件 ①批次培養(yǎng):細(xì)胞培養(yǎng)罐接種細(xì)胞后,經(jīng)37℃培養(yǎng)3 d,再接種狂犬病毒,經(jīng)33℃培養(yǎng)3 d,開始收獲病毒收獲液,每24 h收獲一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)罐工作體積的病毒收獲液。收液時(shí)全部吸出,然后加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);②連續(xù)灌流培養(yǎng):細(xì)胞培養(yǎng)罐接種細(xì)胞后經(jīng)37℃培養(yǎng)3 d,再接種狂犬病毒,經(jīng)33℃培養(yǎng)3 d,開始收獲病毒收獲液,用蠕動(dòng)泵收取病毒收獲液的同時(shí)加入新的培養(yǎng)液,每24 h收獲一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)罐工作體積的病毒收獲液。

1.2.2 病毒收獲液毒力測(cè)定 用Reed-Muench計(jì)算LD50。

1.2.3 病毒收獲液超濾純化 檢定合格的病毒收獲液經(jīng)超濾濃縮60倍、80倍,經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活(1∶4 000、4℃20 h,β-丙內(nèi)酯經(jīng)37℃水解2 h),滅活合格的濃縮液通過層析柱進(jìn)行純化。

1.2.4 疫苗的配制和凍干 純化后的病毒液,加入適量的人血白蛋白作為保護(hù)劑,即為原液,取原液按20%的比例加入賦型劑進(jìn)行分裝凍干,制備出凍干狂犬病疫苗。

1.2.5 疫苗效價(jià)測(cè)定 用N IH法測(cè)定效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方式對(duì)病毒收獲液毒力滴度的影響

圖1 2008-2批次培養(yǎng)病毒收獲液毒力曲線Fig.1 Virulence curve of harvested virus liquid(Lot2008-2)after batch culture

圖2 2008-3連續(xù)灌流病毒收獲液毒力曲線Fig.2 Virulence curve of harvested virus liquid(Lot2008-3)after continuous flow culture

從圖1、圖2看出,批次培養(yǎng)與連續(xù)灌流培養(yǎng)2種培養(yǎng)方法在收獲的病毒收獲液的毒力滴度上沒有明顯區(qū)別,收獲前3次病毒收獲液的毒力逐漸上升,4～7 d達(dá)到最高水平,在收獲20 d后毒力開始下降,到25 d時(shí)明顯降低。細(xì)胞計(jì)數(shù):兩種培養(yǎng)方式細(xì)胞數(shù)均在6×106個(gè)/mL以上。

2.2 不同濃縮倍數(shù)和純化

病毒收獲液超濾濃縮采用60倍和80倍兩種濃度,濃縮液經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活(1∶4 000、4℃20 h,β-丙內(nèi)酯經(jīng)37℃水解2 h)后,通過Sepharose4FF層析柱進(jìn)行純化。

2.3 凍干疫苗賦型劑的選定

凍干賦型劑采用右旋糖酐、海藻糖、甘露醇、蔗糖配制,經(jīng)過試驗(yàn)確定最終濃度,為保證疫苗的加入量,4種賦型劑成分的配制濃度接近飽和濃度,經(jīng)過凍干后的疫苗呈白色疏松狀、無塌陷,復(fù)溶后為澄明液體,無異物。

2.4 液體疫苗與凍干疫苗的效價(jià)比較

結(jié)果見表1、表2。

表1 病毒收獲液經(jīng)60倍濃縮后效價(jià)結(jié)果Table 1 Titer of harvested virus liquid after 60-fold concentration

表2 病毒收獲液經(jīng)80倍濃縮后效價(jià)結(jié)果Table 2 Titer of harvested virus liquid after 80-fold concentration

凍干疫苗與液體疫苗相比效價(jià)下降小于0.5 IU/劑。

2.5 凍干疫苗熱穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果

將凍干后的人用狂犬病疫苗置37℃28 d,然后與在4℃保存的凍干疫苗同時(shí)進(jìn)行效價(jià)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表3 60倍濃縮凍干苗的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Ther mal stability of freeze-dried vaccine prepared with harvested virus liquid after 60-fold concentation

表4 80倍濃縮凍干苗的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Ther mal stability of freeze-dried vaccine prepared with harvested virus liquid after 80-fold concentation

試驗(yàn)結(jié)果顯示:熱穩(wěn)定試驗(yàn)后疫苗與對(duì)照疫苗相比效價(jià)下降小于0.8 IU/劑。

3 討 論

應(yīng)用15 L細(xì)胞培養(yǎng)罐,使用片狀載體,加入量為50 g/L,在細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞的密度可以達(dá)到6×106個(gè)/mL以上,在細(xì)胞接種3 d后,再接種狂犬病毒,將細(xì)胞生長(zhǎng)液換成維持液,再經(jīng)過3 d后開始收獲病毒收獲液。在收獲病毒收獲液的過程中采用批次收獲和連續(xù)灌流培養(yǎng)收獲兩種方式進(jìn)行狂犬病毒收獲液的收集,每24 h收獲一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)罐工作體積,可以連續(xù)收獲25 d(次),病毒收獲液的毒力滴度可以達(dá)到7.0～8.0 lgLD50/mL之間。

檢定合格的病毒收獲液經(jīng)濃縮、滅活和純化后,加入適量人血白蛋白作為保護(hù)劑即為原液,經(jīng)稀釋后即為液體狂犬病疫苗,液體狂犬病疫苗加入賦劑型后,經(jīng)凍干后即為凍干狂犬病疫苗。

疫苗經(jīng)效價(jià)檢定后可以看出,病毒收獲液經(jīng)60倍和80倍2種倍數(shù)濃縮后,制備的疫苗效價(jià)均可以達(dá)規(guī)程要求,疫苗的其他各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)檢定均達(dá)到生產(chǎn)規(guī)程要求。凍干疫苗與液體疫苗相比效價(jià)下降小于0.5 IU/劑,凍干疫苗經(jīng)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)后效價(jià)降低小于0.8 IU/劑。

此生產(chǎn)工藝與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相比,具有染菌率低、單位體積細(xì)胞密度大、所收獲的病毒原液毒力滴度高及脫落細(xì)胞少等優(yōu)點(diǎn)。這樣,在疫苗的生產(chǎn)中可以提高疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量,同時(shí)可以使生產(chǎn)成本大大降低。本生產(chǎn)工藝與采用微載體的罐培養(yǎng)工藝相比,優(yōu)點(diǎn)是由于使用的片狀載體可以將細(xì)胞固定在一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的環(huán)境中,因此不會(huì)受到攪拌系統(tǒng)剪切力的影響而造成細(xì)胞脫落。使用微載體時(shí)培養(yǎng)罐的攪拌速度一般不超過100 r/min,如果高于這個(gè)轉(zhuǎn)速就可能造成細(xì)胞的脫落,而采用片狀載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),攪拌速度可以達(dá)到180～220 r/min,從而使各種氣體、細(xì)胞培養(yǎng)液的交換更加充分,更加有利于pH和DO的調(diào)控,同時(shí)也具有在病毒收獲液中脫落細(xì)胞少的優(yōu)點(diǎn),有利于疫苗的純化。此工藝完全適合用于大規(guī)模人用凍干狂犬疫苗的生產(chǎn)。

[1] 張永振.中國狂犬病流行病學(xué)特征及防治建議[D].全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,2006:64-68.

[2] 李志強(qiáng),官桂范,王研,等.應(yīng)用生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)基因重組CHO細(xì)胞的研究[J].生物工程學(xué)報(bào),1993,9(2):163-165.

[3] 王樹君,代長(zhǎng)海,張瑩,等.用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)VERO細(xì)胞生產(chǎn)高滴度狂犬病毒液[J].中國生物制品學(xué)雜志,2004,17(6):380-382.

[4] 官桂范,李志強(qiáng),王研,等.30 L生物反應(yīng)器連續(xù)灌流培養(yǎng)重組CHO-C28細(xì)胞表達(dá)HBsAg的研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,1999,27(4):45-50.

[5] 劉國詮.生物工程下游技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1993:47-57.

[6] Heath C.,Kiss R.Cell Culture ProcessDevelopment[J].Advances in Process Engineering,2007,23:46-51.

[7] 王妍,李志強(qiáng),葉世德.應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器和新型載體連續(xù)培養(yǎng)CHO-C28細(xì)胞HBs Ag的表達(dá)[J].中國生物制品學(xué)雜志,1993,6(4):161-163.