降香黃檀組織培養(yǎng)技術(shù)研究

陳碧華,姚慶端,李乾振,范輝華,吳培衍

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院,福建福州 350012;2.福建省漳州市林業(yè)局,福建漳州 363000;3.福建省龍海林下國(guó)有林場(chǎng),福建龍海 363118)

降香黃檀組織培養(yǎng)技術(shù)研究

陳碧華1,姚慶端2,李乾振1,范輝華1,吳培衍3

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院,福建福州 350012;2.福建省漳州市林業(yè)局,福建漳州 363000;3.福建省龍海林下國(guó)有林場(chǎng),福建龍海 363118)

在福州,8月和 9月是降香黃檀外植體誘導(dǎo)消毒的好季節(jié),選擇季節(jié)比選擇消毒劑重要。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)升汞消毒效果稍好于次氯酸鈉。在加有青霉素的培養(yǎng)基,青霉素可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖,但不能抑制真菌生長(zhǎng)和繁殖。試驗(yàn)篩選出改良 DCR+BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1作為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、改良MS1+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1的組合適合繼代增殖,改良MS2+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑適合降香黃檀莖芽生根。生根培養(yǎng)基加有活性炭 0.5g·L-1有利于降香黃檀組培瓶?jī)?nèi)生根。

降香黃檀;組織培養(yǎng);培養(yǎng)基

降香黃檀 (Dalbergia odoriferaT.Chen),別名花梨、降香檀、香紅木、花櫚、香枝、花梨木、黃花梨,商品名 SCENTEDROSEWOOD(香紅木),為蝶形花科 (Papilionaceae)黃檀屬 (Dalbergia)樹種,海南本地還分油梨和糠梨,前者心材比例大,棕褐色,后者心材比例小,紅棕色至紫棕色,為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物,海南 5種特類材之一,是我國(guó)最常見的珍貴紅木品種[1]。降香黃檀是我國(guó)海南特有喬木樹種,在海南西部及西南部海拔 400m以下平原或丘陵地區(qū)分布較多。廣東、廣西、云南及福建等地有引種栽培。降香黃檀不僅木材和藥用價(jià)值非常高,而且耐干旱耐脊薄,是一個(gè)值得推廣的珍貴樹種。降香黃檀多為種子繁殖,通過有性繁殖的后代苗木參差不齊。扦插或嫁接等雖可保持原株優(yōu)良特性,但繁殖系數(shù)較低,嚴(yán)重影響良種推廣進(jìn)程。采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù),可在短期內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)良無性系苗木,滿足規(guī)?；炝謱?duì)降香黃檀優(yōu)良種苗的需求,具有重要意義。通過對(duì)比試驗(yàn),探索降香黃檀適宜的組織培養(yǎng)技術(shù),為降香黃檀優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

漳州市林業(yè)局林下林場(chǎng)初步選優(yōu)的降香黃檀單株,以及海南引種的苗期初步選優(yōu)單株,從基部采取半木質(zhì)化枝條做為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌 降香黃檀的枝條做為外植體,很難消毒,尤其是雨季。外植體先用自來水沖洗表面 5-10min,再用洗滌劑溶液浸泡 10-15min后自來水沖洗干凈,然后 0.1%新潔爾滅溶液浸泡 15-20min,自來水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上,用 75%酒精浸泡 30s,0.1%HgCl2消毒 10～12min或次氯酸鈉 (含有效氯 2.6%)消毒 15～18min,無菌水沖洗 4-5次。切去莖段上下兩端,保留長(zhǎng)度約為 1cm左右的帶腋芽莖段接種于外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。[2-5]于外植體培養(yǎng)基加入抗生素青霉素 50ng·L-1,觀察污染情況。

1.2.2 培養(yǎng)條件 外植體誘導(dǎo)前一周不需要光照,以后光照強(qiáng)度 20～25μmol·m-2·s-1;繼代培養(yǎng)光照強(qiáng)度 20～25μmol·m-2·s-1;生根培養(yǎng)光照強(qiáng)度從 20～25μmol·m-2·s-1增加到煉苗光照 40～50μmol·m-2·s-1。培養(yǎng)溫度為 26±2℃,光照時(shí)間 12h·d-1[2]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 外植體培養(yǎng)基 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基采用 (1)MS+BA2.0mg·L-1(以下生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度相同)+NAA0.1;(2)DCR+BA2.0+NAA0.1;(3)改良 DCR(增加KNO3460mg·L-1)+BA2.0+NAA0.1;(4)GD+BA2.0+NAA0.1。以上基本均附加白糖 30g·L-1和瓊脂粉 3.5g·L-1,pH5.8。

1.3.2 繼代培養(yǎng)基 繼代培養(yǎng)基為:(5)MS+BA0.5+ IBA0.01;(6)DCR+BA0.5+ IBA0.01;(7)桉樹繼代培養(yǎng)基 B1+BA0.5+ IBA0.01;(8)1/2MS+BA0.5+ IBA0.01;(9)改良MS1+BA0.5+ IBA0.01。以上基本均附加白糖 30g·L-1和瓊脂粉 3.5g·L-1,pH5.8。

1.3.3 生根培養(yǎng)基 生根基本培養(yǎng)基采用:(10)1/2MS+ IBA0.5+NAA0.2+活性炭 0.5g·L-1;(11)1/2MS+ IBA0.5+NAA0.2;(12)1/2MS+NAA2.0+活性炭 0.5g·L-1;(13)改良MS2+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[6]。

以上基本均附加白糖 20g·L-1和瓊脂粉 3.5g·L-1,pH5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

采用升汞和次氯酸鈉消毒進(jìn)行對(duì)比,效果均不理想,在雨季均出現(xiàn)全部污染的現(xiàn)象。

在外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入抗生素青霉素進(jìn)行外植體誘導(dǎo)對(duì)比試驗(yàn)。青霉素終濃度為50ug/ml,對(duì)比試驗(yàn)表明:青霉素能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng),但不能抑制真菌污染?？傮w上污染率,仍然不能有效控制。

天氣或季節(jié)是影響外植體的主要因素,通過 3個(gè)月 (6月、7月、8月)的外植體誘導(dǎo)試驗(yàn)觀察,發(fā)現(xiàn) 2009年 6月福州天氣為多雨季節(jié),誘導(dǎo) 2次共 52瓶,全部細(xì)菌污染;7月誘導(dǎo) 10次共448瓶,用升汞消毒,8次全部細(xì)菌污染,2次誘導(dǎo)效果比較理想,分別為 68.97%和 41.18%的污染率。8月誘導(dǎo) 2次共 105瓶,污染率分別為 51.16%和 15.79%。從總體上來看,加入抗生素—青霉素,效果不顯著,還不如選擇季節(jié)重要。在福州,8月是外植體誘導(dǎo)消毒的好季節(jié),其次是 7月,6月不適宜。其原因主要?dú)w咎于多暴風(fēng)雨的 6月和 7月,細(xì)菌真菌滋生,這些細(xì)菌真菌往往是內(nèi)生的,難以消毒徹底。目前,試驗(yàn)表明季節(jié)選擇優(yōu)于抗生素選擇。8月誘導(dǎo)外植體,即使不加入抗生素,誘導(dǎo)污染率只有 51.16%-15.79%。9月也是外植體誘導(dǎo)消毒的良好季節(jié),污染率與 8月差不多。

2.2 外植體誘導(dǎo)

表 1 降香黃檀外植體誘導(dǎo)情況

在 4種外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,雖然莖段基部均有愈傷組織產(chǎn)生,但改良DCR有莖芽產(chǎn)生,莖葉顏色綠色,生長(zhǎng)基本正常,所以選擇改良 DCR+BA2.0+NAA0.1作為降香黃檀外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基比較合適。

2.3 繼代增殖

外植體誘導(dǎo)生長(zhǎng)正常的莖芽切下,轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基,觀察莖芽生長(zhǎng)增殖狀況。

表 2 降香黃檀不同繼代基本培養(yǎng)基增殖情況

從表 2可以看出,除了培養(yǎng)基 9號(hào)外,其它 4種培養(yǎng)基均多次繼代后,大多數(shù)莖芽褐化死亡。所以選擇改良MS1作為降香黃檀繼代增殖基本培養(yǎng)基,進(jìn)一步對(duì)降香黃檀繼代增殖所需要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選 (見表 3)。

表 3 降香黃檀不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)繼代增殖影響

從表 3可以看出,BA1.0濃度水平芽多,濃度偏大,抑制芽長(zhǎng)高,而 BA0.1芽增殖倍數(shù)太少。在 IBA0.1時(shí)基部都有大量愈傷組織產(chǎn)生,只有 BA0.5、NAA0.1的組合比較適合降香黃檀繼代增殖。

2.4 生根培養(yǎng)

當(dāng)繼代莖芽長(zhǎng)到 1.5cm高時(shí),切下接種于生根培養(yǎng)基。

表 4 基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)生根的影響

表 4表明:當(dāng)培養(yǎng)基加有活性炭 0.5g·L-1時(shí),莖芽葉片極少脫落,活性炭有利于莖芽生長(zhǎng)。改良MS2+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能促使降香黃檀 90%莖芽生根,葉片極少脫落,選擇該培養(yǎng)基作為降香黃檀生根培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

3.1 在福州,8月和 9月是降香黃檀外植體誘導(dǎo)消毒的好季節(jié),選擇季節(jié)比選擇消毒劑重要。盡管如此,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)升汞消毒效果稍好于次氯酸鈉。在加有青霉素的培養(yǎng)基,青霉素可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖,但真菌污染始終存在,目前還沒有找到適合抑制真菌污染的抗生素。

3.2 試驗(yàn)篩選出改良 DCR+BA2.0+NAA0.1作為降香黃檀外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、改良MS1+BA0.5+NAA0.1的組合比較適合降香黃檀繼代增殖,但繼代培養(yǎng)過程中還有少數(shù)褐化現(xiàn)象和愈傷組織出現(xiàn),不利于組培擴(kuò)大繁殖,需要進(jìn)一步優(yōu)化。

3.3 生根培養(yǎng)基加有活性炭 0.5g·L-1有利于降香黃檀組培瓶?jī)?nèi)生根。改良MS2+生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑適合降香黃檀莖芽生根。生根過程中芽基部仍然有少數(shù)愈傷組織出現(xiàn),不利于組培苗木移栽,需要進(jìn)一步探討。

[1]邱治軍,周光益,陳升華.海南特有珍貴紅木樹種——降香黃檀[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2004(6):41-42.

[2]陳碧華,李乾振,吳麗君,等.巨桉組織培養(yǎng)及工廠化育苗技術(shù)的研究[J].福建林業(yè)科技,2006,33(1):61-63.

[3]Smith R H.Plant Tissue Culture(Second edition)[M].California USA:2000,59-81.

[4]譚文澄,戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1991,40-44.

[5]王玉英,高新一.植物組織培養(yǎng)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:金盾出版社,2006,60-65.

[6]Chen B H.In vitro propagation of amedicinalplant:Tripterygium wilfordiiHook f.[J].Forestry studies in China,2009,11(3):174-178.

STUDY IN THE TISSUE CULTURE TECHNIQUE OFDALBERGIA ODORIFERA

CHEN Bi-hua1,YAO Qing-duan2,L IQian-zhen1,FAN Hui-hua1,WU Pei-yan3
(1.Fujian Academ y of Forestry Sciences,Fuzhou Fujian350012,China;2.Zhangzhou Forestry Bureau,Zhangzhou Fujian363000,China;3.L inxia Forest Far m of Longhai,Longhai Fujian363118,China)

August and September are the suitable season forDalbergia odoriferato be sterilized.The season selection is more improtant than the selection of disinfectors. The sterilizing result showed that the HgCl2was a little better than NaClO.Penicillium could inhibit the gowth and propagation of bacteria,but could not inhibit the gowth and propagation of fungi on the media.Modified DCR supplemented with BA2.0 mg·L-1and NAA0.1 mg·L-1was selected as the explant induction medium,modifiedMS1 supplemented with BA0.5 mg·L-1and NAA0.1mg·L-1was selected as the shoot proliferation medium,and modified MS2 supplemented with the suitable plant growth regulatorswas selected as the shoot rootingmedium.The Activated charcoal 0.5g·L-1was good for shoot rooting.

Dalbergia odoriferaT.Chen;tissue culture;medium

S722.3+7

A

1001-4276-(2010)01-0047-05

2010-07-16

福建省林木種苗科技攻關(guān)降香黃檀項(xiàng)目:降香黃檀優(yōu)良材料選擇與快繁技術(shù)研究(子項(xiàng)目)。

陳碧華 (1967-),博士,高級(jí)工程師,研究方向:林業(yè)生物技術(shù)。

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